摘要
由于缺少高效的控制元件及工具，在多基因代谢通路中基因表达量的微调仍然是一个巨大的挑战，天津工生所的刘君研究员开发了一种可以高效优化谷氨酸棒状杆菌中基因表达的PLMC技术。
首先设计了一个包含-10(NNTANANT)和-35(NNGNCN)的启动子文库，通过FACS筛选、平板筛选、96孔板筛选获得了数量巨大且具有不同强度的启动子。利用RT-PCR、SDS-PAGE、FACS分析及lacZ系统等一些传统技术对筛选出的启动子文库进行进一步的分析，结果证明本文建立的启动子元件可高效的调控基因表达且这些启动子元件具有不同的强度。
随后基于这些高效的启动子元件建立了多模块组合技术来对多基因代谢通路进行优化。利用该技术，作者对苏氨酸代谢通路中5个基因进行了优化，苏氨酸产率提高到12.8g/L，达到对照菌株的6倍。
文章脉络
通常，细菌中的启动子需要组装及RNA聚合酶的激活来起始转录。而σ因子可以识别特定启动子序列来激活RNA聚合酶全酶。
表1.谷氨酸棒状杆菌中σ因子
1. 启动子文库构建
作者按照σA 、σB 两种因子启动子区域保守序列设计了启动子序列并在pXMJ21的基础上利用Golden Gate进行了启动子文库的构建。
2. 高通量筛选
通过fluorescence-activated cell sorting、agarplate screening、96-well plate screening对启动子文库进行高通量筛选。
3. 进一步分析
通过荧光强度分析，启动子可以被分为3种强度：
High-strengthgroup：over 8000 a.u.
Medium strengthgroup：3000-6000 a.u.
Low strengthgroup：200-2000 a.u.
在以上三种强度的启动子中各挑选10个，共30个启动子序列来进行BPROM分析。结果表明：-10区与设计的NNTANANT大致一致，但-35区不保守；软件预测-10与-35之间的距离为10-16bp，而非设计的17bp；High-strengthgroup中的启动子在人工合成的80bp中富含AT，尤其是9-67bp；提出了一个典型的强启动子序列：
SSSYGSTATHMTKWDTMKYKWKYNKGGYGACDWTYWGTDADTKTDYTAAKSTAWARTCTDAWGWKARSGAAAGGAAGKRY
为了进一步确定启动子的表达强度，同时选取谷氨酸棒状杆菌中cg2195(a putative membrane protein)、cg1791(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)、cg3219(lactic dehydrogenase)、cg0587(elongation factor Tu)、cg3237(superoxide dismutase)五个基因的启动子作为对照，利用RT-PCR、SDS-PAGE、FACS、lacZ reporter system等技术对启动子强度进一步分析。
在进行lacZ系统分析时，作者还选取了之前其他实验室筛选出的H36和P7启动子进行了辅证，结果表明H10、H36、P7启动子的半乳糖苷酶活性为8978.6±531MU、6887.6 ± 401MU、5798.3 ± 312.5 MU。
4.利用PLMC技术优化谷棒中基因表达提高苏氨酸产量
以pXMJ22出发利用Golden Gate技术进行多片段的组合，谷棒中苏氨酸代谢通路如下图：
作者首先敲除了编码苏氨酸脱水酶的ilvA和tdcB基因，分别对天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶引入了解除反馈抑制的点突变LysCT311L和HomG378E，同时敲除了编码高丝氨酸乙酰基转移酶的metX基因。得到的菌株rLhdAXB苏氨酸产量为2.1g/L，此外高丝氨酸和赖氨酸产量分别为3.2 g/L和2.3g/L。
随机选取L6、M6、H6对苏氨酸代谢通路中lysC、asd、hom、thrB、thrC五个关键基因进行启动并进行多模块组合。由于LysCT311L作为苏氨酸代谢通路商的关键基因，作者选用强启动子H6对其进行过表达。
进行四因素(4基因)三水平(3种不同强度的启动子)正交实验，如下图：
发酵结果如下图：
发酵结果显示A、B、D、H菌株的苏氨酸产量分别为8.9、10.1、12.8和11.3g/L。D菌株(LHAMHHBMCL)苏氨酸产量最高，是对照菌株的6.1倍，其赖氨酸产量为1.8g/L，也是所有菌株中最低的。
首先副产物赖氨酸的量与Hom的表达量相关，强启动子表达Hom的菌株赖氨酸量均为低水平，可能是Hom的过表达让更多的碳流量流向苏氨酸，进而减少了赖氨酸的产生；其次Hom的过表达会产生一定量的高丝氨酸，而高丝氨酸的存在可能会减轻苏氨酸对ThrB的反馈抑制，因此ThrB的表达与适量的高丝氨酸浓度两者之间需要组合优化从而提高苏氨酸的产量；此外利用强启动子过量表达Asd和ThrC对苏氨酸产量只有微弱的提高。
结论
作者成功构建了一个方便高效且启动子强度跨度大的谷氨酸棒状杆菌启动子文库。基于这些启动子，作者开发出一种快速高效的多片段组合技术PLMC。利用PLMC技术，优化苏氨酸代谢通路，苏氨酸产量有明显提高。此外，更多高通量筛选技术会使PLMC技术更加高效。因此，有理由相信PLMC技术在今后优化细胞工厂、提高目的产物产量中会有广阔的应用前景。
本文于2018年3月21日发表在Applied microbiology and biotechnology。
