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辅酶(coenzyme)是可以将化学基团从一个酶转移到另一个酶上的有机小分子化合物,可作为酶辅因子与酶蛋白形成复合物,对于某些酶的活性发挥起着必要作用。辅酶在自然界中存在较广,常见的有辅酶Q(CoQ)、辅酶Ⅰ(NAD+)、辅酶Ⅱ(NADP+)等。其中,CoQ是一种脂溶性醌类化合物,最早在1957年分离自牛的心脏,其化学结构在1958年得以确定[1]。不同来源的辅酶Q,其侧链的异戊烯单位数目不同。根据其侧链异戊烯单位的数目,人体内的辅酶Q被称为辅酶Q10。
辅酶Q10是一种类维生素物质,它广泛分布于各种动植物和微生物的细胞线粒体中[2],是其自身合成的天然抗氧化剂和细胞代谢激活剂,与呼吸作用密切相关,对于细胞电子信号的传递和ATP的产生具有重要的作用[3]。随着年龄的增加,人体内细胞辅酶Q10的合成逐渐减少。近年来,辅酶Q10的研究不断深入推进,为其广泛应用奠定了良好的基础。研究表明辅酶Q10在人体健康和生活中扮演着至关重要的角色,现已广泛应用于医学、日化、保健、食品等各个不同的领域,成为现如今品质生活的重要组成部分。同时,CoQ10的应用广度日益拓宽,用量也正在快速增长,因此,需要更加高效的生产方法和更加完善的工艺来获得高质量产品,以满足对其日益增长的需求。然而,自然界的生产难以实现工业应用,同时,随着人们生活水平的提高,天然产品越来越受到广大消费者的欢迎,所以,微生物发酵生产辅酶Q10成为人们关注的焦点和研究热点[4]。迄今为止,国内外有关辅酶Q10的综述不在少数,但有关酵母生产辅酶Q10的报道鲜少。本文对近年来辅酶Q10的应用进行归纳,并对酵母生产辅酶Q10以及生产过程中的影响因素和优化检测方法进行综述,以期对酵母生产辅酶Q10提供导向及参考价值,对酵母来源的辅酶Q10提取生产工艺的改进和产品质量的提高具有重要意义。
1 辅酶Q10应用进展随着研究的不断深入,辅酶Q10在不同领域的应用越来越广。在医药行业,辅酶Q10对很多疾病都具有明确的治疗作用,可用于治疗心血管疾病、偏头痛、帕金森氏病、肾衰竭、阿尔兹海默症、运动能力下降、乳癌、慢性阻塞性肺炎、艾滋病(辅助治疗)、男性不育、癫痫、胰岛素抵抗综合症(X综合症)、肺癌、肌肉萎缩、前列腺癌等疾病[5~8]。同时,它还具有清除氧自由基,抗氧化等作用,能够延缓皮肤衰老、抗辐射[9],所以被添加到众多的化妆品、牙膏、洗发水、护手霜等日化产品和保健品中,并受到广大消费者的肯定。在国内,辅酶Q10也开始走进食品领域,可用作食品补充剂[10],同时可以被添加到食用油以及饮料中,对人体具有一定的保健作用[11]。
2 辅酶Q10生产方法研究进展化学合成法、生物组织提取法、植物细胞培养法和微生物发酵法是目前辅酶Q10的主要生产方法。化学合成法具有人工可控的优点,但是合成步骤长、副反应多,其间需多次分离纯化,并且形成的类似物量多,给辅酶Q10的分离纯化带来了很大的困难,导致最终产率较低。动植物体内含有丰富的辅酶资源,通过动植物组织提取法得到的辅酶是天然的,人体吸收好,纯度较高,但因受原材料来源和提取工艺的限制,生产成本相对较高,难以实现规模化的生产。微生物发酵法最早起源于日本。近年来,随着微生物发酵技术的不断改进,微生物发酵法得到了充分的发展,成为近年来国内外研发的热点。微生物发酵法原料来源广、成本低,可以高密度、大规模进行生产,但目前来说其后期分离纯化技术还有待创新以进一步提高产率。目前市场上已有部分企业通过微生物发酵法来生产辅酶。迄今为止,国内外报道只有34个属的微生物含有辅酶Q10,其中细菌和酵母菌占主要部分[12]。然而,细菌体积较小难以控制,且部分细菌带有致病性,这使得酵母菌在辅酶Q10的生产中扮演着重要的角色。
3 酵母发酵生产辅酶Q10的方法研究及工艺3.1 辅酶Q10的发酵目前,文献报道可发酵生产辅酶Q10的酵母菌主要有热带假丝酵母、季也蒙假丝酵母、粘红酵母菌、粟酒裂殖酵母、酿酒酵母、假白布勒弹胞酵母、葡萄汁酵母菌等(表 1)[13~22]。同时,发酵生产辅酶Q10的酵母菌种类还在不断增加,菌种的培养条件和生产手段也在不断的更新和优化。发酵培养基中的碳源、氮源、无机盐、pH值以及发酵过程中的溶氧量对辅酶Q10的产量都具有一定的影响。同时,利用微波、射线、紫外线、激光和各种生物化学方法对菌种的诱变也能在某种程度上提高辅酶Q10的产量。
表 1 发酵生产辅酶Q10的主要酵母菌种Table 1 Main yeast strains for Q10 production |
辅酶Q10是酵母细胞的胞内产物,首先要经过细胞破碎使产物释放出来。酵母细胞膜主要由蛋白质和脂质构成,强度较差,因而细胞壁是细胞破碎的主要阻力。选择合适的细胞破碎方法对辅酶Q10的提取效果十分重要。酵母的细胞壁主要成分是葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质,壁厚约为70 nm。根据细胞破碎的方式不同,辅酶Q10的提取方法有皂化法、溶剂萃取法、超声波法、研磨法、酸热法[23]及一些新型分离方法,如分子蒸馏法、超临界萃取法和萃取结晶法[24, 25]等。
皂化法是经典的提取方法,分为醇碱皂化法和碱皂化法两种[26],操作比较简单,但成本较高。其早期应用较广,随着科技进步和研究的深入,更多新型的方法涌现出来,因此皂化法目前在工业生产上的应用有所减少[27]。溶剂萃取法操作方法较为简单,但是纯化工作较为困难,工业化生产推广难度较大[28]。超声波破壁提取法具有提取效果好、实用性高、成本低、省时等特点,现已被广泛应用。研磨法由于在研磨过程中时间较长,与空气接触面积较大,辅酶Q10在提取过程中容易被氧化分解,所以提取效果较差,且效率低[29]。
不同的提取方法具有不同的优缺点。赵树全[30]用相同的酵母菌比较了不同提取方法的提取效果,结果显示为酸-丙酮萃取法>醇碱皂化法>超声波破碎法,并且随着破碎时间的增加,超声对细胞的破碎率逐渐提高。邱卫华[16]比较了醇碱皂化法、碱皂化法和有机溶剂提取法的提取效率,认为皂化法较有机溶剂萃取法效果更好,且碱皂化法更适合用来提取发酵细胞中的辅酶Q10。刘玲等[31]通过对皂化法和细胞破碎两种提取方法的比较,发现皂化法提取量略高,但更加耗时,脂溶性产物较多;同时,破碎细胞的3种提取方法中,超声波法提取产量最高,且在时间和提取量上都优于搅拌法和研磨法。目前细胞破碎方法应用最多是超声波破碎法,也有人选择多种方法配合使用,例如皂化法结合超声波破碎法,可使辅酶Q10的溶出量更大,提取辅酶Q10的量更多,活性更好[32]。
除了不同的提取方法会影响提取效果以外,辅酶Q10的提取效果还受到诸多因素的影响,例如提取溶剂的选用、提取时间的长短、提取过程中的温度、菌液浓度以及超声波破碎法中的超声波输出功率、超声次数、超声时间/间隔时间和辐射时间[33, 34]。不同提取条件下,不同的方法所得到的产物纯度、活性会有所不同,多种因素综合考虑才能使提取效果更佳。
3.3 辅酶Q10的分离纯化辅酶Q10的分离纯化方法包括传统的硅胶柱层析法、活性氧化铝柱层析法、大孔树脂吸附层析法和近年来应用逐渐广泛的高速逆流色谱法(HSCCC)[35]及高效液相色谱法(HPLC)。
硅胶柱层析法操作方法简单、成本低,但是一般来说使用的硅胶无法进行回收,在一定程度上造成了浪费,同时,有些洗脱液毒性较大,污染较为严重。2011年内蒙古金达威药业有限公司发明了一种辅酶Q10层析硅胶的在线再生方法,使得硅胶使用次数可达100次以上,重复套用的层析效果良好,能达到安全环保的效果[36],为硅胶柱层析方法节约了成本。活性氧化铝获得的辅酶Q10纯度可达99.4%,但是应用成本较高[37]。大孔吸附树脂是一种有机高聚物吸附剂,在纯化过程中,一般首先将含有辅酶Q10的粗酶液通过大孔吸附树脂进行吸附,利用较高极性溶剂除去杂质,再利用正己烷溶液洗脱即能达到纯化辅酶Q10的目的。大孔树脂对辅酶Q10具有良好的吸附性能,解吸操作简单,稳定性好且重复利用次数高,所以大孔树脂层析法使工业化生产操作简便、成本降低,溶剂较易回收利用,再生处理方便。但也存在一些不足,如树脂粒径大小不一使得分离效果不佳,致孔剂的残留与树脂降解物的毒性等。HSCCC和HPLC也可以用来分离纯化辅酶Q10,HSCCC较硅胶柱层析法在辅酶Q10的纯度、回收率以及产率方面效果更优,其回收率高出14%,且相比之下,HSCCC操作简单、分离效率高、溶剂用量少[18]。HPLC虽然应用成本较高,但具有快速、简便、灵敏、准确的优点,目前来说应用依然较为广泛。现在工业上也会将多种方法结合使用,可以扬长避短。如将大孔吸附树脂与硅胶层析方法结合,能够大大降低硅胶纯化的压力,纯化效果更好。
3.4 辅酶Q10的测定辅酶Q10传统的测定方法有薄层色谱、紫外光谱、红外光谱、紫外分光光度法、高相液相色谱法等。薄层色谱、紫外光谱、红外光谱早期应用较多,通过三种方法的综合判定在测定判别辅酶Q10上效率较低,准确度不够,现应用较少。目前大多数研究都会选择薄层色谱-紫外分光光度法和(TLC-UV)和HPLC。
TLC-UV法相对于HPLC定量分析法来说误差较大,但其具有方法简便、操作时间短、成本低、样品处理简单的优点,是一种比较实用的辅酶Q10定量测定方法。高效液相色谱法具有快、灵、准的优点,但其测定成本较高。同时,还有一些其他的新型方法也被用来进行辅酶Q10的测定,如:傅里叶变换近红外光谱(FT-NIR)[38],超临界流体色谱-质谱联用法(SFC-MS/MS)[39],液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)[40],超高液相色谱-质谱联用法(UPLC-MS、UPLC-MS/MS)[41, 42]这些新型方法精确度较高,但成本较昂贵,所以研究人员可根据不同的精确程度和成本考量来选择合适的检测方法。
3.5 辅酶Q10的工业化生产工艺尽管我国对辅酶Q10的开发研究起步较晚,但近年来,对其研发的脚步越来越快,有些提取方法已经实现了工业化生产。2008年天辰神舟实业有限公司和中国空间技术研究院共同申请了有关于一种提取细菌细胞内辅酶Q10工艺的专利,其辅酶Q10的收率高达90%以上,已实现自动化操作,有利于提高工效、节能、降低成本。该工艺溶剂回收率达95%~99%,在节约溶剂成本的同时有利于安全生产,并且大大降低了有机溶剂对环境的污染[43]。苏州科技学院也对传统的提取方法进行了改进,利用研磨法结合超声波破碎法提取菌体中的辅酶Q10,显著提高了辅酶Q10的提取含量,缩短了提取时间,且方法简单易行,便于操作,降低了成本,有利于辅酶Q10的工业化生产[44]。
4 前景与展望辅酶Q10属于泛醌类物质,自20世纪60年代发现以来,在无数研究人员的探索下,其产生机制和作用逐渐明晰。辅酶Q10的缺乏与若干临床疾病都具有密切的联系,它可以通过细胞自身合成,也可以通过各种食品来进行摄取。额外的补充对人体具有抗氧化、延缓衰老、提高免疫力等积极作用。辅酶Q10已经与人们的生活密切联系,息息相关。目前,除了传统的生产方法以外,对于辅酶Q10的生产研究已经开始尝试通过改变基因或则构建工程菌来提高辅酶Q10的生产,其中,主要工程菌为酵母菌和大肠杆菌。调研发现产辅酶Q10工程菌的构建主要分为两类:一是通过将酵母菌或其他物种中的关键酶基因利用基因载体导入大肠杆菌中,使其生产辅酶Q10,例如,根癌杆菌(Agrobacterium tumefaciens)[45]、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)[46]等,二是通过将外源基因导入到产酶酵母中,促进关键酶基因高效表达来增加辅酶Q10的合成能力。研究人员将外援基因转入栗酒裂殖酵母中,辅酶Q10的产量提高了2.68~3.09倍[47]。虽然我国对于辅酶Q10的研究起步较晚,但追赶脚步一步步加快,近年来,我们对于提高辅酶Q10产量的方法不断革新,但依旧还有很长的路要走。据Zion Research公司发表的报告称,2014年全球各地对辅酶Q10的需求达到687.2吨、市值2.5亿美元;预计到2020年,市场需求将达到1 180吨、价值8.5亿美元。因此辅酶Q10生产方法的创新不仅对提高辅酶Q10的产量具有代表性的作用,同时,对于满足未来人民对辅酶Q10的消费量、提高人民的生活质量来说具有重要的意义,并能带来一定的经济效益。
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