益生菌微囊制备中常用的包衣技术与材料

Coating Technology and Materials Used in Preparation of Probiotics Microcapsules

纪 瑞1, 2，邵 雷2，王 健1，陈代杰2,3*

(1. 中国医药工业研究总院药物制剂国家工程研究中心，上海 201203；2. 中国医药工业研究总院上海医药工业研究院，

创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 201203；3. 上海交通大学药学院，上海 200240)

益生菌( probiotics) 是指一类当摄入足量时能对宿主健康产生促进作用的微生物，具有调节肠道菌群、增强机体免疫力、降低胆固醇等功效[1]，目前在世界范围内被消费者接受。研究表明，益生菌必须是“活的”和“足量的”才能发挥作用，因此美国FDA 推荐食品中活性益生菌的添加量最低限为106 CFU/g 或106 CFU/ml [2]。益生菌对外界的不利环境非常敏感，氧气、温度、湿度等对益生菌的存活有很大影响，可导致其在生产、运输和销售过程中活菌数大幅减少。此外，益生菌在进入消化道后多数不能耐受胃酸、胆盐和多种消化酶的破坏，难以保持足够的活菌数到达肠道定植，从而发挥作用[3]。微囊化技术(microencapsulation) 是一种包埋益生菌的有效手段，采用天然或合成的高分子材料为囊材，通过化学、物理或物理化学法将活性物质即囊芯包裹起来形成具有半透性或密封性囊膜的微型胶囊。益生菌微囊的粒子大小通常为5 ～400 μm，囊壁的厚度为0.2 ～ 10 μm。将益生菌微囊化之后，能在一定程度上使其与外界环境隔离，提高其对不利环境的耐受性。此外，可以通过选择具有特殊性能的壁材，赋予微囊化后益生菌在肠道内定位、缓慢释放的能力[4]。目前用于制备益生菌微囊的常用方法为挤压法、乳化法和喷雾干燥法。

1 益生菌微囊包衣技术

益生菌微囊包衣技术又称为微囊涂层技术，是指在益生菌微囊化之后，在其表面进行包衣( 涂层)，减少益生菌在高氧、高pH 值环境中的暴露[10]。有些涂层如壳聚糖还能够赋予微囊一些特殊的功能，如可提高微囊在肠道中的生物黏附能力，显著延缓微囊中益生菌在肠道内的释放[11]。目前应用最广泛的包衣技术为层层自组装法( layer bylayer assembly，LBL) 和凝聚法(coacervation) ；最常用的包衣材料包括海藻酸钠、壳聚糖、L- 赖氨酸、乳清蛋白等。

1.1 层层自组装法(LBL)

LBL 技术在20 世纪末首次被应用于制造多层薄膜，通过将带正电的平面固体底物浸入含阴离子的聚电解质溶液中，完成薄膜之间的层层组装[12]。LBL 的技术原理主要基于聚合物材料之间的氢键和静电相互作用。LBL 技术用于益生菌微囊包衣时，主要是利用两种不同材料所带的电荷种类不同，依靠静电作用引起不同材料之间的相互黏附和聚集。利用这种原理，可将微囊置于与壁材表面电荷相反的多种聚合物溶液中，在微囊粒子的表面进行层层自组装包衣。

Krasaekoopt 等使用LBL 法设计了一种两层包衣的海藻酸钠微囊( 图1)[13]。首先制备骨架疏松、孔隙率高的带负电荷的海藻酸钠微囊，然后以3 ∶ 20 的质量比将该海藻酸钠微囊悬浮于相对分子质量为1 000 ～ 4 000 的带正电荷的多聚赖氨酸溶液中，使其表面电荷由负电荷转变为正电荷，而后又通过将其浸没于低浓度海藻酸钠溶液中利用静电黏附形成聚电解质络合膜完成第二层包衣，从而显著改善微囊表面疏松多孔的性质，并提高其表面硬度，减少微囊在胃液中的破裂及益生菌的泄露。

1.2 凝聚法

凝聚法应用于益生菌微囊包衣的基本原理是将微囊分散于一种或几种( 单凝聚或多凝聚法) 不相容的高分子聚合物溶液( 凝聚相) 中，通过调节pH 值、温度等反应条件或加入化学或酶促交联剂等使聚合物溶解度降低，导致体系发生相分离，从而将聚合物沉积在微囊的表面，随后发生固化，再使用离心或过滤等分离方法得到微囊，实现微囊的表面包衣[11]。如Annan 等通过凝聚法对载青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis 15703T 的明胶微囊进行包衣[16]，首先将明胶微囊分散于海藻酸钠溶液中，然后加入到植物油中形成乳状液，再向此乳状液中加入含有凝聚剂Ca2+ 的水相，水相中海藻酸钠形成不溶于水的海藻酸钙，沉积在明胶微囊的表面，实现明胶微囊的包衣( 图2)。该法由于操作相对复杂，反应条件要求严格，并且难以制得粒径较小的益生菌微囊，所以较少应用于益生菌微囊的包衣。但研究表明，通过改变凝聚相的组成和浓度、聚合物溶液的搅拌速度等可改善微囊最终的粒径大小、表面形态和内部孔隙率，完善最终的包衣效果[17]。凝聚法的用途十分广泛，除了用于益生菌微囊的包衣外，还可用于多种微囊的制备，如微生物、香料、防腐剂和一些酶等的包埋。

2 微囊包衣材料

2.1 海藻酸钠(sodium alginate)

海藻酸钠是源于褐藻或细菌的一类天然高分子聚多糖，由β-D- 甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid，M) 和α-L- 古洛糖醛酸(α-L-guluronic acid，G) 按( 1→4) 糖苷键连接而成( 图3)，其G 单元上的Na+ 能与二价阳离子如Ca2+、Ba2+ 等发生交换，分子内交联成类似“蛋盒”的网络结构，从而转变成不溶于水的海藻酸钙凝胶[18]。海藻酸钠安全无毒、价格低廉、成胶过程简单温和，对益生菌的保护效果突出，因而广泛地应用于益生菌的微囊化及包衣。

2.2 壳聚糖(chitosan)

壳聚糖是一种由葡萄糖胺和N- 乙酰葡萄糖胺经β-1,4 糖苷键连接而成的天然线性阳离子多糖( 图4)，广泛存在于甲壳类动物的硬壳、真菌细胞壁和昆虫角质层中。壳聚糖天然无毒，可生物降解，具有良好的生物相容性与生物黏附性，因此广泛应用于食品、保健品、医药等行业。壳聚糖分子中带有大量的伯胺基，在溶液pH 值低于其pKa 值(6.5)时会发生电离而带有一定的正电荷[22]，因此可与带负电的聚合物如海藻酸钠等静电结合，通过LBL技术在表面带有负电荷的微囊表面进行包衣，是目前所有益生菌微囊包衣材料中保护效果最好、最常用的材料之一。用壳聚糖包衣大多是通过将微囊浸泡于壳聚糖溶液中进行的，包衣效果的优劣取决于壳聚糖的相对分子质量、乙酰化程度、浓度，溶液pH 值以及浸泡时间等，其中前二者对微囊的缓释效果和强度影响最大，有研究表明在一定范围内，微囊强度随着壳聚糖相对分子质量的降低而提高[23]。

2.3 多聚赖氨酸(poly-L-lysine，PLL)

PLL 是一种来源于链霉菌属细菌的、由23 ～25 个L- 赖氨酸通过ε- 酰胺键连接而成的天然多肽( 图5)，安全无毒，广泛用作食品添加剂。PLL结构中带有大量氨基，因此当pH 值低于其等电点(pI=9) 时带正电荷，可与阴离子物质结合，近年来被用作多种给药系统的包衣材料，在益生菌微囊包衣领域也有大量的研究与应用[28]。

2.4 乳清蛋白(whey protein)

乳清蛋白是一种来源于牛奶的蛋白质，具有良好的凝胶特性和生物相容性，可通过凝胶反应形成具有超高密度的网状结构，因此广泛用作微囊的囊壁材料和包衣材料。乳清蛋白具有两性性质，在溶液pH 值高于其等电点时带正电荷，可与带负电的物质如海藻酸钠、卡拉胶、果胶等结合，从而在使用这些材料制备的微囊表面包衣[32]。有研究表明，经乳清蛋白包衣的微囊在胃部环境中具有较强的缓冲能力，能使囊内保持相对较高的pH 值，显著提高益生菌在胃酸中的存活率[33]。

3 总结与展望

随着益生菌产品的研究和开发逐渐增多，益生菌微囊技术备受关注，其中微囊包衣技术简单高效，保护效果好，是益生菌微囊技术的研究热点。在常用的包衣技术中，LBL 技术因成本低、效率高而成为首选。在常用包衣材料中，海藻酸钠和PLL 是否能够提高保护效果的争议最大，故近几年的研究逐渐减少，而壳聚糖和乳清蛋白的包衣效果较好，是近年来研究最多、应用最广的包衣材料。此外利用海藻酸钠和乳清蛋白包衣时使用的方法多为凝聚法，而PLL 和壳聚糖因带正电荷，包衣时使用的方法多为LBL 法。

除单层包衣技术外，双层或多层包衣技术也逐渐被开发，如目前研究较多的海藻酸钠- 壳聚糖-海藻酸钠(APA) 双层包衣微囊。尽管益生菌微囊包衣技术的研究逐渐增多，但其在上市产品中的应用却还很缺乏，多数停留在研究阶段，究其原因主要是微囊制备装置不成熟，生产成本高，制备材料与包衣材料的生物相容性、安全性与有效性存在争议等。因此开发新型包衣技术与材料，探讨包衣技术和材料的适用范围和机制应是下一步重点进行的工作。

基金项目：国家自然基金项目(81373310、81573329、81773616)、上海市自然基金项目(16ZR1435400)、上海市优秀技术带头人计划(17XD1423200)

作者简介：纪 瑞(1995—)，女，硕士研究生，专业方向：药物制剂。

E-mail：ruiji0506@163.com

通信联系人：陈代杰(1957—)，男，教授，从事微生物药物研究开发。

Tel：021-20572000×2049

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