联系方式：刘磊,E-mail：toleiliu@gmail.com。通信作者张名位,E-mail：mwzhh@vip.tom.com
目的
建立龙眼乳酸菌发酵的优化工艺条件,明确乳酸菌发酵前后其挥发性风味物质的变化,为龙眼功能性饮料的开发提供指导。
方法
采用梯度浓度驯化法将乳酸菌（保加利亚乳杆菌﹕嗜热链球菌=1﹕1）依次接入到含60%、70%、80%、90%（质量分数）龙眼果浆和10%脱脂乳的混合物中进行驯化,分析驯化过程中龙眼果浆酸度和pH的变化;以总酸为指标,通过Box-Benhnken中心组合试验设计优化乳酸菌发酵龙眼果浆的工艺条件,建立包括发酵时间、发酵温度、脱脂奶粉添加量和接种量的4因素回归模型;采用顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用的方法分析龙眼果浆发酵前后主要挥发性风味物质变化。
结果
（1）经过梯度浓度驯化后,得到了能在高浓度龙眼果浆中发酵的乳酸菌,经过12 h发酵,90%龙眼果浆的酸度由9.5 ºT升至104.4 ºT,pH由7.12降至4.44,其酸度显著高于60%和70%的龙眼果浆（ P<0.05）,而pH与60%、70%和80%龙眼果浆无显著差异（ P>0.05）。
（2）经回归模型并结合验证试验,确定乳酸菌发酵龙眼果浆的最佳工艺条件为：发酵时间12 h、发酵温度45℃、脱脂奶粉添加量5%、接种量3%。在该条件下,龙眼果浆的酸度由发酵前的9.5 ºT升为105.1 ºT,与模型预测值的相对误差为1.2%,可用于实际生产中预测。
（3）龙眼果浆经乳酸菌发酵后其挥发性风味物质发生了显著变化。共有53种挥发性物质被检测出,其中萜烯烃类15种、醇类6种、酯类18种、酮类7种、醛类3种、酸类2种以及其他类2种。与发酵前相比,龙眼果浆发酵后新产生了18种挥发性风味物质。发酵后醇类、醛类、酯类、酮类和酸类挥发性风味物质的含量呈增加趋势,而萜烯烃类含量呈降低趋势。乳酸菌发酵龙眼果浆主要挥发性风味物质为乙醇25.68 μg·g-1、4-（1-甲基乙基）-苯甲醇2.42 μg·g-1、乙醛1.95 μg·g-1、苯甲醛1.25 μg·g-1、乙酸乙酯2.19 μg·g-1、苯甲酸甲酯1.05 μg·g-1、水杨酸甲酯1.93 μg·g-1、3-羟基-2-丁酮1.085 μg·g-1、反式-罗勒烯97.81 μg·g-1、别罗勒烯1.923 μg·g-1、乙酸1.84 μg·g-1,其中苯甲醛和乙酸乙酯由发酵产生,乙醇、乙醛、别罗勒烯及乙酸经发酵后含量增加。
结论
乳酸菌发酵显著增加龙眼果浆的总酸及挥发性风味物质,通过优化控制发酵条件,可以开发风味独特的龙眼乳酸菌饮料新产品。
【Objective】The optical fermentation conditions of longan pulp by lactic acid bacteria were established, and the change of volatile flavor compounds of longan pulp before and after fermentation was clarified. This research can guide the development of functional longan beverage. 【Method】Lactic acid bacteria (Lactobacillus bulgavicus﹕ Streptococus thermophilus=1﹕1) was domesticate in the medium containing 60%, 70%, 80% and 90% longan pulp and 10% skim milk. The acidity and pH of longan pulp were analyzed during the domestication. The conditions of fermented longan pulp by lactic acid bacteria were optimized through Box-Benhnken central composite experimental design based on the indicators of total acid. A regression model of four factors was established including the fermentation time, fermentation temperature, the content of skim milk powder and inoculation amount of lactic acid bacteria. Separation and analysis of the main volatile flavor compounds in longan pulp before and after fermentation were performed by headspace solid phase micro extraction and gas chromatography - mass spectrometry. 【Result】The lactic acid bacteria with good fermentation ability was obtained in longan pulp with high concentration. After 12 h of fermentation, the acidity of 90% longan pulp increased from 9.5ºT to 104.4ºT, and pH decreased from 7.12 to 4.44. The acidity of 90% longan pulp was significantly higher than that of 60% and 70% longan pulp ( P<0.05), there was no significant difference of pH between longan pulp with four concentrations. The results showed that the optimum conditions are as follows: fermentation time 12h, fermentation temperature 45℃, 5% the content of skim milk powder and 3% inoculation amount of lactic acid bacteria. Under this condition, the acidity of fermented fruit pulp increased from 9.5ºT to 105.1ºT. The relative error to the value predicted by the model was 1.2%. It indicated that this model can be used in practical production. The volatile flavor compounds in longan pulp significantly changed after the fermentation. 53 volatile flavor compounds were detected in fermented longan pulp, which contained 15 terpenes, 6 alcohols, 18 esters, 7 ketones, 3 aldehyde, 2 acids and 2 others. 18 volatile flavor compounds were newly produced by fermentation. After the fermentation, the contents of alcohols, aldehydes, esters, ketones and acids increased, and the contents of terpenes decreased. The main volatile flavor compounds in fermented longan pulp were ethanol 25.68 μg·g-1, 4-(1-methylethyl)- benzenemethanol 2.42 μg·g-1, acetaldehyde 1.95 μg·g-1, benzaldehyde 1.25 μg·g-1, ethyl acetate 2.19 μg·g-1, methyl benzoate 1.05 μg·g-1, methyl salicylate 1.93 μg·g-1, 3-hydroxy-2-butanone 1.085 μg·g-1, (E)-β-ocimene 97.81 μg·g-1, allo-ocimene 1.923 μg·g-1, and acetic acid 1.84 μg·g-1, respectively. Benzaldehyde and ethyl acetate were newly generated. The contents of ethanol, acetaldehyde, allo-ocimene and acetic acid increased after the fermentation. 【Conclusion】 Lactic acid bacteria fermentation significantly increased total acid and volatile flavor compounds of longan pulp. Longan pulp beverage fermented by lactic acid bacteria with a unique flavor can be developed by controlling fermentation conditions.
【研究意义】龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是中国南方珍贵水果, 其果肉营养价值丰富, 有滋补强体、补益心脾、养血安神、益智宁心等多种功效[1, 2]。中国龙眼年产量120万t以上, 居世界首位, 其成熟期集中, 不耐贮藏, 需要进行深加工。目前龙眼主要加工成龙眼干、果汁饮料、果酒等产品。此外, 龙眼还可以通过生物酶解、超高压等高新技术提取活性成分开发保健食品[2]。因此, 发展龙眼精深加工, 对提升产品附加值、促进产业持续健康发展、满足消费者需求显得尤为迫切。乳酸菌发酵食品不但能降低血糖, 还有调节肠胃, 增强免疫等功能作用[3]。采用乳酸菌发酵果蔬可以开发集果蔬的营养价值与乳酸菌的保健功能于一体的新型发酵饮料, 已经成为果蔬深加工的新途径[3]。而风味物质是评价果蔬饮料品质的重要因素, 研究龙眼果浆乳酸菌发酵工艺及其对风味物质的影响对开发龙眼果浆饮料具有重要指导意义。【前人研究进展】国内外已有很多学者利用乳酸菌发酵果蔬汁开发功能性饮料。Yoon等[3]采用4种乳酸菌混合发酵番茄汁, 经过72 h发酵后, 其pH下降至4.1, 酸度增加了0.65%。Demir等[4]研究了乳酸菌不同浓度接种量对胡萝卜汁发酵品质的影响, 发现接种量为3× 105cfu/g时, 发酵胡萝卜汁的品质最好。吴兴壮等[5]优化了苹果汁乳酸菌发酵饮料的制备工艺。目前, 关于龙眼乳酸菌发酵饮料的报道还较少, 刘建福等[6]报道了龙眼汁凝固型酸乳的研制, 最佳发酵工艺条件为龙眼汁与鲜牛乳的比例为1﹕9, 接种量5%, 滴定酸度76— 80 oT, 发酵温度42℃, 发酵时间2.5 h。徐安书等[7]以龙眼、胡萝卜、番茄混合汁为原料制备了乳酸菌饮料。由于乳酸菌在果浆中的发酵性能差, 以上对于果蔬乳酸菌发酵的研究主要集中在果蔬汁上, 而关于乳酸菌发酵果浆的研究鲜有报道。此外, 挥发性风味物质是影响乳酸菌饮料品质的重要因素。张义等[8]采用顶空固相微萃取-气质联用方法分析了‘ 储良’ 龙眼中的芳香物质, 共检测出41种挥发性化合物, 主要成分为反-罗勒烯（81.2%）、乙醇（1.92%）、别-罗勒烯（1.39%）、γ -松油烯（0.30%）、β -月桂烯（0.30%）、里那醇（0.26%）。Zhang等[9]采用顶空固相微萃取, 同时蒸馏萃取及水蒸气蒸馏萃取方法发现新鲜龙眼经存放发霉后风味成分发生了显著变化。Chang等[10]发现龙眼经过干燥, 酮类和醇类挥发性风味物质减少, 呋喃和酯类风味物质增加。【本研究切入点】迄今为止, 乳酸菌发酵果蔬的研究多集中在果蔬汁上, 未对果肉进行发酵利用, 造成了资源浪费。龙眼果肉含糖量高, 众多消费者为了控制血糖, 对一般的甜型果汁饮料望而生畏。通过微生物发酵降低水果中的糖度开发健康饮品已成为水果加工的新潮流。然而, 目前尚未见采用乳酸菌发酵龙眼果浆的报道, 其发酵前后挥发性风味物质的变化亦不清楚。【拟解决的关键问题】采用渐进驯化法获得在高浓度龙眼果浆中具有良好发酵性能的乳酸菌, 优化其发酵条件, 分析龙眼果浆乳酸菌发酵前后的挥发性风味成分变化, 旨在为龙眼功能性饮料的开发提供指导。
试验于2011年6月至2012年10月在广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室内完成。
1.1.1 材料 试验龙眼品种为‘ 储良’ , 由广东省农业科学院果树研究所提供, 种植于广东省农业科学院果树研究所实验农场内, 采收时间为2011年7月, 采收后用冰覆盖, 运送至实验室于-10℃冷库保存备用。菌种：保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgavicus, GIM1.189）和嗜热链球菌（Streptococus thermophilus, GIM1.540）, 购于广东省微生物菌种保藏中心; 脱脂奶粉购于广州市晋炜盛食品有限公司。
1.1.2 仪器与试剂 胶体磨, 廊坊通用机械有限公司; 磨浆机, 温岭市泽国大众电器厂; 高压杀菌锅, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂; PB-10 pH酸度计, 德国Sartorius公司; LRH-250生化培养箱, 上海一恒科技有限公司; JJ-CJ-1F超净工作台, 吴江市净化设备总厂; 6890N-5975B气相-质谱仪, 美国Agilent公司; SPME萃取头及手柄, 美国Supelco公司。
试剂：环己酮, 色谱纯, 美国Fluka公司; 其他常规试剂均为分析纯, 购于广州市东红化学厂。
1.2.1 龙眼果浆乳酸菌发酵的工艺流程
1.2.2 操作要点
（1）乳酸菌的活化及驯化
参考杨胜敖等[11]的方法进行菌种的活化及驯化。菌种活化：取脱脂奶粉10 g和无菌水90 g调制成10%的乳液, 以1/4的灌装量装入试管中, 塞好棉塞, 115℃杀菌15 min。迅速冷却至40℃左右, 在无菌条件下接乳酸菌菌种（保加利亚乳杆菌﹕嗜热链球菌=1﹕1）, 接种量为4%（v/w）, 42℃恒温培养12 h, 取出, 以此法重复3次, 使其充分活化。
菌种驯化：采用梯度浓度驯化法对乳酸菌进行驯化培养, 将乳酸菌种（接种量4%）依次接入到含60%、70%、80%和90%（质量分数）龙眼果浆和10%脱脂乳的混合物中, 42℃下培养至凝乳, 经过3次驯化后, 混合菌种的生长良好且凝乳快, 可作为发酵剂, 保存在4℃左右的冰箱中备用。并分析菌种驯化过程中不同时间点龙眼果浆的酸度及pH。
（2）龙眼果浆的发酵
龙眼经清洗、去皮、去核并打浆, 取95.0 g果浆加入脱脂奶粉搅拌均匀, 用Na2CO3溶液调节pH至7.2, 杀菌（105℃杀菌15 min）, 迅速冷却至45℃左右, 接入一定量的乳酸菌发酵12 h后放入4℃的冰箱中后熟24 h, 再取样分析。
1.2.3 龙眼果浆乳酸菌发酵的工艺优化试验 在前期单因素试验的基础上进一步优化龙眼果浆发酵工艺条件, 以发酵时间（X1）、发酵温度（X2）、脱脂奶粉添加量（X3）和接种量（X4）作为四因素, 以发酵酸度为考察指标, 根据 Box-Benhnken中心组合实验设计原理, 设计四因素三水平的响应面试验, 试验因素水平见表1。
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表1 试验因素水平表 Table 1 Variables and levels in central composite design |
1.2.4 龙眼果浆发酵前后挥发性风味物质的固相微萃取方法 参照Zhang等[12]方法。取5.0 g龙眼果浆发酵乳, 置于15 mL顶空瓶中, 加5 μ L 100 mg· L-1的环己酮为内标, 放入转子, 立刻用PTFE/硅橡胶隔垫密封, 置于50℃磁力搅拌器上加热平衡15 min, 使用DVB/CAR/PDMS 50/30 μ m（二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷）三层复合萃取头萃取, 透过隔垫插入SPME萃取针头, 插入深度为2 cm, 推出萃取头, 顶空吸附30 min。萃取结束后样品供GC-MS分析, 萃取纤维头在GC进样口解析5 min。称样和萃取均重复3次。顶空瓶中放未经发酵的龙眼果浆为空白对照试验。
1.2.5 龙眼果浆发酵前后挥发性风味物质的GC/MS检测 参照Zhang等[12]方法, 具体条件如下：
色谱条件：Agilent 6890N气相色谱仪配弹性石英毛细管柱HP-5MS（30 m× 0.25 mm× 0.25 μ m）, He流量1 mL· min-1, 不分流进样, 进样口温度250℃。升温程序：起始柱温35℃保持5 min, 然后以3℃/min的升温速率升温到150℃, 10℃/min的升温速率升温到240℃, 保持2 min。
质谱条件：Agilent5975B MSD质谱, 电离方式EI, 电子能量70 eV, 灯丝发热电流0.25 mA, 电子倍增器电压1 000 V, 离子源温度200℃, 接口温度280℃, 扫描速度全程（40— 550）AMU/sec。
1.2.6 定量分析方法
（1）酸度的测定：参照GB5413.34— 2010用标准0.1 mol· L-1 NaOH溶液滴定制品的酸度[13]。称取5.00 g龙眼果浆发酵乳, 放入烧杯中, 加入10 mL煮沸后的冷却水, 混匀, 用NaOH标准溶液电位滴定至pH 8.3, 记录消耗的NaOH标准溶液的毫升数, 代入公式（1）中计算。
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式中：
X— — 样品的酸度（º T）;
c— — NaOH标准溶液的摩尔浓度（mol· L-1）;
V— — 滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）;
m— — 试样的质量（g）;
0.1— — 酸度理论定义NaOH的摩尔浓度（mol· L-1）
（2）pH的测定：用PB-10 pH酸度计测定pH。
（3）挥发性风味物质的定量分析：发酵龙眼果浆风味物质的定量采用内标法, 用面积归一化法将内标物环己酮的峰和每个组分的峰面积进行比对, 计算每
个峰的具体含量, 计算方法[14]如下：
1.2.7 数据处理 单因素试验采用SPSS 19.0统计分析软件进行结果分析, 响应面试验数据采用Design expert.v8.0.6软件处理。风味物质经过GC-MS分析鉴定后, 其结果用计算机谱库（NIST 05/WILEY）检索和人工图谱解析共同分析, 并结合相关的文献报道。
乳酸菌驯化过程中龙眼果浆的酸度及pH变化如图1所示。随着发酵时间的延长, 4种不同浓度龙眼果浆的酸度显著升高（P< 0.05）, pH显著下降（P< 0.05）。未经驯化的乳酸菌直接接入90%的龙眼果浆中生长缓慢, 发酵性能差, 发酵12 h, 其酸度为60 º T。经过梯度浓度驯化后, 乳酸菌渐渐适应高浓度龙眼果浆的生长环境, 发酵12 h, 90%龙眼果浆的酸度由9.5 º T升至104.4 º T, pH由7.12降至4.44, 其酸度显著高于60%和70%的龙眼果浆（P< 0.05）, 与80%龙眼果浆无显著差异（P> 0.05）。4个不同浓度的龙眼果浆在发酵12 h时的pH无显著差异。
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图1 乳酸菌驯化过程中龙眼果浆的酸度与pH变化Fig. 1 Acidity and pH of longan pulp during the domestication of lactic acid bacteria |
以发酵时间X1、发酵温度X2、脱脂奶粉添加量X3和菌种接种量X4为试验的4因素, 以发酵酸度Y为考察指标。具体结果见表2。利用Design expert.v8.0.6软件对试验结果进行多元回归拟合, 对表2的数据结果进行回归分析, 得到二次多项回归方程模型：
Y=97.52+4.05X1+1.05X2+5.39X3+0.54X4-0.35X1X2- 0.25X1X4-0.2X2X4-0.025X3X4-0.46X12-7.43X22- 0.22X32-0.59X42 （2）
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表2 响应面试验设计与结果 Table 2 Experimental design and results of response surface |
回归模型的方差分析（表3）表明, 该回归模型达到极显著水平（P< 0.0001）; 失拟项P=0.1807> 0.05, 不显著, 说明该回归方程预测值与实际测定值拟合较好。模型复相关系数的平方R2为0.9866, 说明该方程拟合度较高, 故该模型可以用于本工艺的实际推测。对各项F值检验可知, 发酵时间、发酵温度、脱脂奶粉添加量和发酵温度二次项P< 0.01, 为显著影响因素, 而接种量和各因素间的交互项对试验结果无显著影响。由表中的P值可知, 各因素对发酵龙眼果浆酸度的影响程度从强到弱依次为：X3> X1> X2> X4, 即脱脂奶粉添加量> 发酵时间> 发酵温度> 接种量。模型的相关系数R2=0.9866, 大于90%, 表明酸度和脱脂奶粉添加量、发酵时间、发酵温度及接种量之间呈显著相关性, 模型调整系数R2Adj=0.9733, 说明该模型能解释97.33%响应值的变化。逐项显著性结果检验表明方程中一次项X1、X2、X3及二次项X22对酸度的影响极显著（P< 0.01）, 而交互项对试验结果无显著影响。
| 表3 回归模型方差分析 Table 3 Analysis of variance with regression model |
通过响应面软件分析, 得到乳酸菌发酵龙眼果浆的最佳工艺条件为：发酵时间12 h、发酵温度45.13℃、脱脂奶粉添加量5%、接种量3.21%, 在此试验条件下, 龙眼果浆发酵酸度最大理论值为106.33 º T。结合实际操作及应用的便利, 确定龙眼果浆发酵的最佳工艺条件为：发酵时间12 h、发酵温度45℃、脱脂奶粉添加量5%、接种量3%, 经试验验证, 在此最优条件下龙眼果浆发酵酸度由发酵前的9.5 º T升为105.1 º T, 与理论预测值的相对误差为1.2%, 证明该模型可用于实际生产中进行预测。
龙眼果浆发酵前后的挥发性风味物质种类及含量见表4。从表4可以看出, 龙眼果浆发酵前有53种挥发性物质, 其中萜烯烃类23种（共111.39 μ g· g-1）、醇类9种（共26.71 μ g· g-1）、酯类14种（共8.975 μ g· g-1）、酮类3种（共1.442 μ g· g-1）、醛类3种（共0.692 μ g· g-1）、酸类1种（共0.678 μ g· g-1）等。发酵前的龙眼果浆主要挥发性风味成分为乙醇22.80 μ g· g-1、4-（1-甲基乙基）-苯甲醇2.66 μ g· g-1、苯甲酸甲酯2.68 μ g· g-1、水杨酸甲酯3.09 μ g· g-1、反式-罗勒烯104.69 μ g· g-1、别罗勒烯1.73 μ g· g-1、2-甲基-苯并呋喃1.09 μ g· g-1（表4）。发酵后的龙眼果浆共检出53种挥发性物质, 其中萜烯烃类15种（共104.9 μ g· g-1）、醇类6种（共29.3 μ g· g-1）、酯类18种（共9.27 μ g· g-1）、酮类7种（共3.189 μ g· g-1）、醛类3种（共3.45 μ g· g-1）、酸类2种（共1.631 μ g· g-1）以及其他类2种（共0.379 μ g· g-1）等。发酵后的龙眼果浆中主要风味物质成分为乙醇25.68 μ g· g-1、4-（1-甲基乙基）-苯甲醇2.42 μ g· g-1、乙醛1.95 μ g· g-1、苯甲醛1.25 μ g· g-1、乙酸乙酯2.19 μ g· g-1、苯甲酸甲酯1.05 μ g· g-1、水杨酸甲酯1.93 μ g· g-1、3-羟基-2-丁酮1.085 μ g· g-1、反式-罗勒烯97.81 μ g· g-1、别罗勒烯1.923 μ g· g-1、乙酸1.84 μ g· g-1。
| 表4 龙眼果浆乳酸菌发酵前后挥发性物质含量 Table 4 The content of main volatile components in before and after fermentation of longan pulp |
龙眼果浆经乳酸菌发酵, 其挥发性风味物质发生了显著变化。发酵后的龙眼果浆中有35种挥发性风味物质与发酵前相同, 另生成了18种新的风味物质, 以酮类、酯类为主; 发酵后醇类、醛类、酯类、酮类和酸类挥发性风味物质的总量都相对增加, 而萜烯烃类总量则降低, 同时出现了两种其他类物质。发酵后的龙眼果浆新产生的挥发性风味物质主要是苯甲醛、3-羟基-2-丁酮、乙酸乙酯, 这3种物质含量分别为1.245、1.085和2.193 μ g· g-1。
（1）萜烯烃类：通过GC-MS检测到发酵前龙眼果浆挥发性成分中萜烯烃类的化合物种类最多, 达到23种, 包括正烷烃, 支链烷烃, 环状烷烃, 不饱和烷烃及芳香烃, 而发酵后只有15种。其中反式-罗勒烯无论在发酵前还是发酵后含量都最高, 分别为104.69 μ g· g-1和97.81 μ g· g-1; 发酵前含量最低的物质是辛烷与1-乙基-3-甲苯, 都为0.027 μ g· g-1, 发酵后含量最低的是对二甲苯, 为0.049 μ g· g-1。龙眼果浆经乳酸发酵后出现了2种新的萜烯烃类化合物, 分别为3-甲基己烷（0.802 μ g· g-1）和十七烷（0.068 μ g· g-1）。
（2）醇类：醇类物质发酵前共检测出9种, 其中含量最高的是乙醇（22.80 μ g· g-1）, 最低的是2-庚醇（0.024 μ g· g-1）; 发酵后检测出的醇类物质有6种, 其中含量最高的物质也是乙醇（25.68 μ g· g-1）, 而最低的则为正己醇（0.095 μ g· g-1）。发酵后新增了2种醇类物质, 分别是2, 3-丁二醇（0.544 μ g· g-1）和香叶醇（0.193 μ g· g-1）, 主要来源于发酵过程中氨基酸转化及亚麻酸降解物的氧化[15]。
（3）酯类：酯类物质发酵前共检测出14种, 其中含量最高的是水杨酸甲酯（3.087 μ g· g-1）, 最低的是肉豆蔻酸乙酯（0.033 μ g· g-1）; 发酵后检测出的酯类物质有18种, 其中含量最高的是乙酸乙酯（2.193 μ g· g-1）, 而最低的是肉豆蔻酸乙酯（0.030 μ g· g-1）。发酵后果浆中新增了4种酯类物质, 分别是乙酸乙酯（2.193 μ g· g-1）、2-丁烯酸甲酯（0.303 μ g· g-1）、邻氨基苯甲酸甲酯（0.171 μ g· g-1）、肉豆蔻酸异丙酯（0.031 μ g· g-1）。
（4）酮类：酮类物质发酵前共检测出3种, 其中含量最高的是2-甲基-苯并呋喃（1.089 μ g· g-1）, 最低的是3-辛酮（0.128 μ g· g-1）; 发酵后检测到的物质有7种, 其中含量最高的是3-羟基-2-丁酮（1.085 μ g· g-1）, 而最低的是6-甲基-3, 5-庚二烯-2-酮（0.064 μ g· g-1）。发酵后果浆中新产生了5种酮类物质, 分别是2, 3-戊二酮（0.244 μ g· g-1）、3-羟基-2-丁酮（1.085 μ g· g-1）、2-庚酮（0.189 μ g· g-1）、6-甲基-3, 5-庚二烯-2-酮（0.064 μ g· g-1）和2-十一烷酮（0.493 μ g· g-1）。
（5）醛类：醛类物质发酵前共检测出3种, 其中含量最高的是乙醛（0.465 μ g· g-1）, 最低的是4-乙基苯甲醛（0.085 μ g· g-1）; 发酵后检测到的醛类物质也有3种, 其中含量最高的物质也是乙醛（1.953 μ g· g-1）, 而最低的则是癸醛（0.252 μ g· g-1）。
（6）酸类：酸类物质发酵前只检测出1种, 为乙酸（0.678 μ g· g-1）; 发酵后检测到的酸类物质则有2种, 分别是乙酸（1.184 μ g· g-1）和辛酸（0.447 μ g· g-1）。
（7）其他类：龙眼果浆在发酵后检测出2种其他类的物质, 分别为2, 6-二甲基吡嗪（0.113 μ g· g-1）和[1aR-(1aα , 4α , 4aβ , 7bβ )]-1a, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7b-八氢-1, 1, 4, 7-四甲基-1氢-环丙[e]薁（0.266 μ g· g-1）。
乳酸菌在高浓度果浆中的发酵性能差是制约龙眼果浆乳酸菌饮料开发的主要因素。未经驯化前, 乳酸菌在高浓度龙眼果浆中生长缓慢, 其活菌数增长率低, 酸度较小, 发酵12 h约60 º T。为提高其发酵性能, 本研究采用渐进驯化法得到了在高浓度龙眼果浆中具有良好发酵性能的乳酸菌, 驯化后不同浓度龙眼果浆发酵12 h的酸度由96.7 º T（60%）提高到104.4 º T（90%）（P< 0.05）。马新新等[16]采用渐进驯化法对酸菜汁中的乳酸菌进行耐高糖驯化, 其耐糖浓度从48%提高至55%, 活菌数可达3.6× 108cfu· mL-1。驯化后的乳酸菌还有待进一步分离纯化, 深入研究其发酵性能, 为果蔬乳酸菌产品的开发提供更多指导。
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是普遍应用于食品中的乳酸菌, 大量研究结果显示, 杆菌和球菌之间存在共生作用, 在发酵初期, 杆菌能分解整个体系中的蛋白质而形成氨基酸和多肽, 从而促进球菌的生长, 随着发酵体系酸度的增加和氧气的耗尽, 球菌的生长受到抑制, 杆菌生长加快, 两个菌种的混合发酵优于单一菌种[17]。本试验选择了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按1﹕1比例混合进行发酵, 经过工艺优化, 发酵12 h可使得95%龙眼果浆的酸度由9.5 º T升高至105.1 º T, 发酵果浆可进一步用于制备浑浊型龙眼乳酸菌饮料。目前, 关于果浆的乳酸菌发酵报道较少, 主要集中在果汁上。徐安书等[7]采用德氏乳杆菌和嗜热链球菌在发酵温度37℃, 接种量4%, 脱脂乳2%, 混合果蔬汁比例3﹕6﹕1（龙眼汁﹕胡萝卜汁﹕番茄汁）条件, 发酵24 h, pH达4.1, 与本研究的结果相当; 郑欣等[18]采用不同单一乳酸菌发酵荔枝汁, 发现明串珠菌的发酵性能最好, 经过96 h发酵, 荔枝汁的pH达3.3, 总酸达31 g· L-1, 酸值高于本研究的结果, 这主要是因为不同的乳酸菌种发酵能力存在差异, 其次也说明乳酸菌在果浆中的发酵能力会受到抑制。
此外, 前人的报道在乳酸菌发酵果汁工艺中常常添加葡萄糖或白砂糖等外加糖源[5, 7, 19], 导致研发的饮料糖含量高, 不适合肥胖症及糖尿病等特殊病人饮用, 而本研究在未添加其他糖源的条件下采用渐进驯化法得到了能适应高浓度龙眼果浆发酵的乳酸菌, 同时在发酵工艺优化中亦未添加其他糖源。本研究不仅实现了龙眼果肉的全利用, 还为开发适合肥胖症及糖尿病等特殊病人饮用的低糖型乳酸菌发酵果蔬饮料提供了有益探索。
挥发性风味物质是影响果蔬饮料品质的重要因素。发酵龙眼果浆的风味物质主要来源于原料本身和乳酸菌发酵后产生的代谢产物。其中, 酯类化合物是发酵果浆中一种很重要的挥发性风味物质, 大多具有果香、花香、蜜香或者酒香, 主要是由醇类与酸类缩合反应、酶反应或者脂肪酸水解和微生物代谢产生[20]。虽然酯类化合物在GC-MS的检测结果中含量不高, 但其风味阈值非常低, 对整个体系的风味作用贡献很大。醛类也是发酵果浆中重要的挥发性风味物质, 其风味阈值也较低, 是各种氧化风味的重要来源[21]。本研究结果表明, 龙眼果浆发酵后乙醛和苯甲醛的含量显著增加。前人研究指出, 乙醛的产生量与发酵菌株和所用原料有密切关系[22]。它的主要来源是由保加利亚乳杆菌分泌的苏氨酸醛缩酶催化苏氨酸合成, 也可以由乳糖代谢中的丙酮酸盐直接脱羧生成[23, 24]。而苯甲醛是由苯丙氨酸或色氨酸转化产生的。酸类物质对发酵果浆的风味贡献主要体现在滋味上, 气味表现不明显[25]。醇类物质由于风味阈值高, 对发酵果浆的风味贡献并不大[20, 26]。龙眼果浆经乳酸菌发酵后产生了18种新的风味物质, 主要有苯甲醛、3-羟基-2-丁酮及乙酸乙酯。这与前人报道乳酸菌发酵产品的风味物质一致。吕加平等[17]也发现, 采用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌按1﹕1比例混合发酵脱脂乳能产生乙醛、丙酮、乙酸乙酯、丁二酮及异戊醇等风味物质。此外, 特征性的挥发性物质不仅取决于挥发性成分的种类和含量, 同时还与感觉阈值和物质之间的相互作用密切相关, 须通过人体嗅觉感官分析和化学分析相结合才能完成[27, 28]。发酵龙眼果浆特征性风味物质的确定还有待更进一步的研究。
本研究在未添加其他糖源的条件下采用渐进驯化法获得了在高浓度龙眼果浆中具有良好发酵性能的乳酸菌, 建立了龙眼果浆乳酸菌发酵的优化工艺条件（发酵时间12 h、发酵温度45℃、脱脂奶粉添加量5%、接种量3%）。龙眼果浆经12 h发酵其酸度由9.5 º T升至105.1 º T, 发现乳酸菌发酵可显著增加龙眼果浆的挥发性风味物质的种类及含量。解决了乳酸菌在高浓度果浆中发酵性能差的难题, 提高了龙眼的利用率, 拓宽了龙眼的利用途径, 通过控制发酵工艺条件, 可以开发糖含量低、风味独特的龙眼果浆乳酸菌饮料新产品, 同时也为将甜型水果开发成适合高血糖消费者饮用的产品提供了新思路。
The authors have declared that no competing interests exist.
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