导读
红酵母是海洋微生物的优势种群,广泛存在于世界各个海域、南北极及深海等领域。海洋是一个高压(深海)、低营养、低光照,以及温度和盐度变化巨大的独特环境,从而使其中的酵母细胞内代谢和产物有异于陆地环境生存的酵母。海洋红酵母细胞含有丰富的蛋白质、类胡萝卜素、多糖、虾青素、不饱和脂肪酸、必需氨基酸、消化酶类、维生素等活性代谢产物,具有较高的营养价值和活性作用,不仅用以生产类胡萝卜素、单细胞蛋白和生物柴油,还可用于微生态制剂,净化水质,在医药、食品、化工、农业和环保等领域有着广泛的应用。
海洋红酵母大小约为4-6μm,营养物质丰富,适口性好,不易沉淀,有较好的耐盐性,同时还具有培养周期短、适应能力强、成本低等优点,非常适宜作为海产动物幼体的开口饵料和幼体时期的补充性饵料,能显著提高水产动物幼苗存活率,提高饲料利用率,增强动物体免疫力,净化水体,是生态养殖的优良添加剂。海洋红酵母作为养殖微生态制剂在水产养殖业中已经有广泛的应用,并推广到了广西、海南、江苏、浙江、山东等十几个省市。与一般海洋环境相比,南极具有低温、高盐、低光照、寡营养、强辐射等极端环境特点,孕育了包括酵母在内的丰富的低温微生物资源,能够产生独特的代谢物质。因此,本研究以极地红酵母Rhodotorula mucilaginosa AN5为实验对象,研究其发酵培养的最佳生长条件,初步探讨作为养殖微生态制剂在水产养殖业中应用的可能性。
1材料与方法
1.1 实验菌株
海洋极地酵母Rhodotorula mucilaginosa AN5是从第22次南极科学考察采集的海冰样品中分离所得。
1.2 酵母培养基及培养
YPD培养基:葡萄糖2.0g,蛋白胨2.0g,酵母粉1.0g,pH=6.0,海水100mL,0.1MPa下灭菌30min。将活化4d的酵母接种于液体YPD培养基中,120r·min-1,20℃摇床培养。
1.3 酵母密度测定
采用显微计数法。
1.4 海参的养殖
实验用海参为仿刺参幼苗,购自山东威海,长约0.5-0.8cm。将幼参随机分到6个玻璃缸中人工养殖(3个为对照组,3个为实验组),每天定时投喂等量人工配合饲料,实验组每天另投喂0.3g红酵母,每2天换水1/2,2个月后,收集海参,吸干表面水分,−20℃保存。
1.5 成分测定方法
水分含量测定采用国标GB5009.3-2010直接干燥法;蛋白质含量测定根据国标GB5009.5-2010凯氏定氮法;粗脂肪含量测定采用索氏抽提法;多糖含量测定采用亚甲基蓝比色法。
1.6 数据分析
试验数据为3次生物学重复平均所得,以平均值±标准误差表示,用软件SPSS 15.0中的one-way ANOVA进行方差分析和差异显著性比较,P<0.05为差异显著,P<0.01为极显著差异。
2结果与分析
2.1 培养条件对酵母发酵生长的影响
2.1.1 碳源对酵母生长的影响
分别以2%的玉米淀粉、蔗糖、糖蜜、玉米面、豆面、小米面代替YPD培养基中的葡萄糖,其他成分和培养条件不变,4d后显微计数法测定菌体密度(图1)。6种碳源物质中,以糖蜜为碳源进行发酵培养时,酵母细胞密度达到最大值1.19×107 cells·mL-1,其次为小米面0.91×107 cells·mL-1,玉米淀粉、玉米面、豆面和蔗糖都约为0.65×107 cells·mL-1,显著小于前2种。糖蜜含有海洋红酵母生长所必需的营养成分、维生素及微量元素等,发酵时明显优于其他碳源。同时糖蜜是大宗廉价原料,价格便宜,综合考虑发酵菌量与生产成本,糖蜜为酵母菌培养的最佳碳源。分别以1.0%、2.0%、3.0%和4.0%浓度的糖蜜培养红酵母,酵母细胞密度见图2。结果发现2%的糖蜜发酵液中酵母细胞密度最大,为1.46×107 cells·mL-1,明显高于其他浓度,由此确定2%糖蜜为酵母培养的最佳碳源。
2.1.2 氮源对酵母发酵的影响
以上述优化的2%的糖蜜为碳源,分别以液体玉米浆、固体玉米浆、糖蜜、玉米面、酵母粉、黄豆饼粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾为氮源,发酵培养4d后,测定酵母细胞密度(图3)。在10种氮源物质中,对AN5生长量的作用大小为酵母粉>大豆蛋白胨>蛋白胨>玉米面>固体玉米浆>硝酸钾>液体玉米浆>糖蜜>黄豆饼粉>硫酸铵。在8种有机氮源中,以酵母粉作为氮源进行发酵培养时,酵母细胞密度达最大值1.3×107 cells·mL-1,因此选取酵母粉作为发酵培养的最佳氮源,与杨莺莺等的研究结果一致。两种无机氮源中,硝态氮的作用效果远高于铵态氮,杨莺莺等对酵母RH1的发酵研究表明,硫酸铵和氯化铵作氮源时生长缓慢,与本研究结果一致。筛选出最佳氮源后,分别以0.25%、0.50%、0.75%和1.0%酵母粉浓度培养酵母(图4)。有图可知,以浓度为0.5%的酵母粉进行发酵培养时,发酵液中酵母细胞密度可以达到2.03×107 cells·mL-1,随酵母粉浓度增加酵母细胞密度基本不变。考虑到发酵的密度和成本,选择0.5%酵母粉为酵母培养的最佳氮源。
2.1.3 初始pH对酵母生长的影响
以上述优化的碳氮源为培养基,调节初始pH值,使其pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,培养4d后测定菌体的密度(图5)。当pH=3.0时,发酵液中酵母细胞密度最大,为1.19×107 cells·mL-1;当pH=2.0时,菌体密度迅速下降,达到最低密度值0.32×107 cells·mL-1;当pH>3时,随pH的增大,细胞密度变小,但下降缓慢,pH=8.0时密度仍为0.54×107 cells·mL-1。由此可知,海洋酵母细胞培养的最适初始pH=3.0,显著低于常温酵母最适pH为4.0-5.0的报道。
2.1.4 温度对酵母生长的影响
以上述优化的碳氮源为培养基,分别在10℃、15℃、20℃、25℃和30℃下培养酵母菌,4d后酵母细胞密度见图6。由图可知,当温度从10℃升高到20℃时,菌体密度达到最大值0.96×107cells·mL-1。其后随温度的继续升高,酵母密度显著下降。因此,AN5菌株生长的最适温度为20℃,发酵时应控制在这一温度。酵母菌的最适生长温度因种属或菌株的来源不同而有所差别,杨莺莺等和童应凯等发现海洋红酵母Rhodotorulasp.的最佳培养温度为28℃,郭馨泽等实验证明海洋红酵母003菌株的最佳生长温度为22℃。实验中所用酵母为海洋极地酵母,属适冷酵母种类,在低温环境下仍能保持活力,一般低于常温酵母的最适生长温度25-28℃。2.1.5装液量对酵母生长的影响在250mL的三角瓶中加入培养基和酵母种子液,使其终体积分别为30、50、70、90、110、130、150mL,4d后对菌液密度进行测定(图7)。当装液量为50mL时,酵母细胞密度达最大值0.99×107cells·mL-1;装液量为30mL和70mL时,细胞密度显著降低;当装液量大于70mL时,菌体密度无显著变化,维持在0.58×107cells·mL-1。装液量的不同对酵母菌生长的影响体现在两个方面:
(1)装液量越大,营养物质含量越多,为酵母菌的生长提供物质保证;
(2)装液量越大意味着剩余空间越小,三角瓶内空气越少,随着时间增加,瓶内氧气消耗,废气增多,对酵母菌的生长起到抑制作用。
本实验中,50mL/250mL的装液量为酵母生长的最佳体积,与郭馨泽等的研究结果一致。
2.1.6 转速对酵母生长的影响
以优化的碳氮源为培养基,装液量为50mL/250mL,设置摇床的转速分别为80、100、120、140、160和180r·min-1,4d后对菌液密度进行测定(图8)。由图8可以看出,随着摇床转速的增加,酵母发酵密度呈上升趋势,由80r·min-1时的0.93×107cells·mL-1到140r·min-1时的1.59×107cells·mL-1,增加了71%。此后,随转速的升高,菌体密度几乎无变化,故本实验的最佳摇瓶转速为140r·min-1。摇瓶培养的转速和装液量对菌体发酵密度的影响因素基本一致,影响培养基中氧气的含量,转速越高,培养基中氧气的含量增加,利于酵母菌的生长繁殖,但当氧气含量达到一定限度后,酵母菌的密度就不再增加。经上述条件优化,得到了极地红酵母AN5的最佳发酵条件,此时酵母密度达到5.81×107cells·mL-1,与周鲜娇等的研究结果类似,但低于其他常温红酵母。
2.2 极地红酵母主要成分含量的测定
以优化后的培养条件大量发酵红酵母AN5,所得菌体进行水分和主要营养成分的测定。经测定,极地红酵母AN5的平均含水量为69.15%。主要营养成分测定结果见表1,从表中可以看出,干酵母中粗蛋白含量约为42.00%,与常温红酵母中蛋白质含量相似,符合水产养殖中养殖动物对生物饵料的蛋白需求。粗脂肪含量仅为0.39%,显著低于蔡诗庆等测定的4.67%-6.35%。总糖是生物体能量的主要来源,酵母菌AN5的总糖含量为32.08%,高于常温酵母,充足的糖类可被用以生物体生长能源的消耗,在水产养殖中发挥重要作用。
2.3 极地红酵母对幼参水分和主要营养成分的影响
以每天投喂0.3g鲜酵母喂养海参幼苗,2个月后,测定海参体内的水分和主要营养成分含量(图9)。正常养殖的海参,含水量为92.02%,投喂红酵母的海参,含水量为91.83%,水分含量没有显著差异;投喂红酵母后,蛋白质干重由35.84%增加到43.19%,含量显著提高;脂肪含量由7.77%变为7.95%,无明显变化;但添加红酵母的海参中多糖的含量为6.75%干重,较对照的5.46%增加了23.63%。
3讨 论
3.1 酵母菌的发酵生产
酵母菌的大规模发酵生产是红酵母应用的前提和基础。科学家研究发现,不同的培养条件和发酵工艺会影响海洋红酵母的生物量,通过调整培养基中碳源、氮源、无机盐、生长因子等物质的种类和添加量,改变培养过程中的pH值、接种量、装液量、通气量等条件,可显著提高酵母菌的产量。本实验所用碳氮源均为工业发酵原料,廉价易得,经过发酵工艺的优化,酵母细胞密度增加了6.21倍,达到了常温酵母发酵的生物量,为酵母细胞的大规模发酵生产奠定了基础。但本实验仅对单一的碳氮源进行了筛选,已有研究表明多种营养物质的组合更有利于酵母的生长,这是下一步研究的方向。另外,该研究只以生物量为指标进行了发酵优化,发酵条件对主要功能活性因子的影响有待进一步研究,以提高酵母菌的营养价值。值得一提的是,该红酵母的最佳发酵温度为20℃,最适初始pH为3.0。低温和低pH值培养可抑制杂菌的生长、减少污染。
3.2 红酵母作为饲料添加剂的应用
潜力红酵母是一种在海洋中广泛存在的单细胞微生物,复杂的生存环境造就了体内独特的代谢产物和活性物质,且酵母本身无毒副作用,安全性高,在果实保鲜、畜禽养殖等方面有着广泛的应用。
海洋红酵母及其发酵产物富含蛋白质、糖类、虾青素、维生素、矿物质等,含有较多的必需氨基酸,营养全面,是集营养与保健为一体的养殖微生态制剂,这些特殊营养成分弥补了常规饵料(或添加剂)的营养缺陷,可以提高水产动物抵抗力,减少抗生素的使用,提高水产品质量。海洋红酵母Rhodotorula sp.作为微生物饵料在水产苗种培育领域的应用始于20世纪90年代,科学家们进行了大量的研究。陈昌福等和Yang等研究发现,饵料中添加海洋红酵母能够提高对虾的成活率和生长速率,使血清中抗氧化酶系统活性增强,增加对环境因子的耐受力。孙建男等综述文献指出,海洋红酵母对养殖动物的生长免疫有明显的促进作用,可能是由于酵母生长中产生的消化酶类、维生素、生长因子等,促进了动物的消化吸收,提高了饲料的利用率。但张瑞玲等在白鱼粉为主的大菱鲆饲料中添加海洋红酵母,则不能提高大菱鲆的摄食和生长性能。
本研究中,极地红酵母蛋白质和多糖的含量较高,作为微生态制剂应用于幼参的养殖中,能显著提高海参中蛋白和多糖的含量。海参饲喂酵母后,可在幼参体内存活定殖,体内超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、淀粉酶、纤维素酶、褐藻酸酶、一氧化氮合酶、胰酶、脂肪酶等酶类活性显著升高,促进了饵料的消化和吸收,使海参体内的蛋白质和多糖等主要营养成分物质含量增加,对生长具有较明显的促进作用,免疫反应增强,抗病力和存活率提高。同时,红酵母作为营养型生物饵料直接为稚参提供营养物质,可提高海参幼体变态率和成活率。除此之外,酵母具有较高的硝化能力,可有效去除海参养殖污水中的亚硝酸盐,改良养殖水质。这些研究为酵母在海参养殖中的应用奠定了理论基础。
南极红酵母易于大规模发酵生产,且营养价值丰富,具有作为水产饵料生物的潜力,是较好的饲料原料,可用作鱼粉等蛋白源的替代物,具有良好的市场前景和开发潜力。
