摘要由微生物和植物产生的聚酮类化合物（PK）的数量庞大，是一大类结构多样化和生物活性多样性的天然产物，已经成为新药的重要来源。综述了3种类型聚酮类化合物生物合成基因簇的特点，即以模块形式存在的I型聚酮合酶、包含一套可重复使用结构域的Ⅱ型聚酮合酶以及不需要ACP参与，以植物中的查耳酮合酶为代表的Ⅲ型聚酮合酶。介绍了近年来组合生物合成技术的基本原理、聚酮合酶的基本作用机制以及合成途径的研究进展。
关键词聚酮类化合物；应用；组合生物合成；微生物药物
中图分类号R978.1文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）03-0024-03
PolyketideandItsApplication
FENG Jian-fei 1ZHOU Ri-cheng 2GUO Xing-ting 1ZHANG Yang 1
（1 Life Science College，Nanjing Agricultural University ，Nanjing Jiangsu 210095； 2 State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement）
AbstractThe polyketides from microorganisms and plant which are comprise of a large and structurally diverse family of bioactive natural products，are still indispensable for drug discovery. Three types of polyketide synthase were briefly introduced，including the modular（TypeⅠ）PKS，TypeⅡ polyketides，in the synthesis of which a set of discrete monofunctional proteins were repeatedly employed and Type Ⅲ PKSs（chalcone synthase-like protein）that does not require acyl-carrier proteins（ACPs）.The status of combinatorial biosynthesis technology in microbial medicine researches including polyketides and the machineries of three types of polyketide synthase were also mentioned in this paper.
Key wordspolyketide；application；combinatorial biosynthesis；microbial medicine
微生物种类繁多，其产物化学结构丰富，生物活性十分广泛，是开发各种新产品的丰富资源，但是传统的筛选方法已远不能满足社会发展的需要。随着分子生物学和生物技术的发展以及基因组学、蛋白质组学、生物信息组学，特别是代谢组学研究的进一步深入，人们对微生物基因组的研究也有了显著进展。国内外专家已经阐明了许多与微生物代谢有关的生物合成基因，从而为微生物药物研究新方法的应用奠定了良好基础[1-4]。近年发展起来的组合生物合成技术可以在微生物正常代谢途径的基础上合成许多新的非天然化合物。聚酮类化合物是由聚酮类化合物生物合成途径合成的化合物的总称。包括大环内酯类、四环素类、蒽环类、聚醚类等的化合物。由于生物合成途径中构件的改变及其组合方式千变万化，可形成的化合物的数量极其庞大。结构的多样性导致了生物活性的多样性。每年聚酮来源的药物的销售额达80亿美元。通过研究聚酮生物合成途径而发展起来的组合生物合成近几年取得了很大的发展，是获取生物多样性的重要手段，成为新药开发的重要策略之一[5-8]。
1抗生素中的聚酮类化合物
抗生素（antibiotics）是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。
由于抗生素耐药性及化疗药物毒副作用的存在，促使人们不断发现新的抗生素类药物。但从天然产物中寻找活性强、毒性低的抗生素越来越困难。因此，科学家求助于组合生物合成技术合成新的“天然产物”用于新药的发现。运用组合生物合成技术通过对抗生素或其他“天然产物”生物合成途径中合成酶基因的操纵，实现对先导化合物结构改造及合成非天然的“天然产物”。在天然产物，尤其是聚酮类化合物生物合成的研究中，组合生物合成技术大有作为。
聚酮化合物是由细菌、真菌、放线菌或植物所产生的一大类天然产物，是用于人类疾病治疗的重要药物之一。由于其重要的生物活性在临床应用中可以作为抗生素（如红霉素，erythromycin A）、抗真菌剂（如两性霉素，amphotericin B）、抗癌药物（如多柔比星，doxorubicin）、抗寄生虫剂（如阿维菌素，avermectins、杀虫剂（如多杀菌素，spinosyn A）以及免疫抑制剂（如雷帕霉素，rapamycin）等。
聚酮化合物是次级代谢产物中最大的一类，包括大环内酯、四环类、蒽醌类和聚醚类在内的许多化合物。由于这些化合物在抗感染、抗真菌、抗肿瘤、免疫抑制等方面的巨大应用价值，吸引了各国科学家对该类化合物生物合成途径进行深入研究，以期获得利用基因工程方法改造和合成聚酮化合物的资料。
由于聚酮化合物的特殊结构和合成机制、非凡的多功能性和可塑性使得人们可以通过组合生物合成方法便捷地获得由其他方式难于得到的新化合物。应用组合生物合成的方法直接地对聚酮化合物生物合成途径中涉及的一些酶的编码基因进行操作，如模块/结构域的增加、减少、替换等，产生一些非天然的基因组或杂合基因而可能改变原有的生物合成途径，从而可间接地对聚酮化合物的生物合成进行调控，以获取大量新的聚酮化合物或其衍生物。
2聚酮生物合成酶的分子机制
微生物的次级代谢产物生物合成由多酶体系参与，这些多酶体系中的各个酶系按照一定组织结构协调起作用。聚酮类化合物是由细菌、真菌、放线菌或植物等产生的一大类天然产物，结构多种多样，但其生物合成有着共同的机制，即均由多酶体系――PKS催化。据国内外最新研究报道，目前所发现的PKS大体上可归纳为PKSⅠ、PKSⅡ、PKSⅢ等3种类型，现着重介绍这3种类型PKS的结构性质、作用机制及其生物合成途径的改造研究情况。
2.1PKSⅠ
PKSⅠ主要由酮基合成酶（ketosynthase，KS）、烯醇还原酶（enoylreductase，ER）、酰基转移酶（acyhransferase，AT）、脱氢酶（de-hydratase，DH）、酮基还原酶（ketoreductase，KR）等功能域组成。KS、AT和ACP是链延伸反应的“最小PKS”。由AT选择1个延伸单元（extending unit），通常为乙酸或丙酸，连接到链上，KS催化缩合反应，ACP吸住链并接收从AT而来的延伸单元，以备下一步缩合反应。属于PKSⅠ的聚酮产物包括雷帕霉素、红霉素、利福霉素和阿维菌素以及新研究的洛伐他汀和埃波霉素。
2.1.1红霉素。红霉素是PKSⅠ产物的典型，也是目前研究最为透彻的。它的PKS具有模块式结构，由3个蛋白（DEBS1、DEBS2、DEBS3）组成，分别由eryAⅠ、eryAⅡ、eryAⅢ基因编码，且每个蛋白由2个延伸模块（extending module）组成，加上1个起始模块（AT-ACP，loading domain，LD），共有7个模块。每个延伸模块至少含有KS、AT和ACP等3个基本功能域，某些模块还包含KR、DH和ER等功能域。模块m2、M3、M6、M7有KR功能域；模块M5有KR、DH和ER功能域；而模块M4仅有最小PKS，且不含任何还原性功能域。模块m2由AT-ACP开始，该AT-ACP域称为荷载域，使链的延伸由丙酰CoA开始，m2～M7连续加入6个丙酸延伸单元，使链延伸，而延伸完成的长链由硫酯酶（thioesterase，TE）功能域催化环化成红霉素的前体6-脱氧红霉内酯B （6-deoxyerythronolide B，6-DEB）。
2.1.2其他较新的PKSⅠ型组合生物合成聚酮类化合物。最近2年，国外许多公司已经利用组合生物合成技术对一些天然化合物进行改造，从而得到一些非天然活性化合物。如美国加州高新技术产业公司（Kosan生物技术公司）的埃波霉素已进入1期临床。这些结果表明，不同来源的功能域并没有底物专一性，而根据克隆的不同基因最终获得的产物与预计无明显差别，说明这些功能域在不同PKS中都能发挥相应的酶催化活性，为组合生物合成的进一步发展奠定了基础。利用该技术可以得到许多“非天然”具有活性的化合物，该技术的深入应用将依赖于抗生素生物合成基因簇结构与功能的阐明。
2.2PKSⅡ
PKSⅡ又称迭代或芳香（iterative）类PKS，其主要合成芳香族的化合物，如蒽环类及四环类化合物等。大部分PKSⅡ型基因由编码最小单位PKS的3个阅读框架组成，即KS/AT、ACP和CLF（链长决定因子）。在生物合成芳香族化合物过程中它们被重复使用，因此又称为迭代型PKS（iterative PKS）；此外还有KR、芳香化酶（aromatase）、环化酶（cyclase）等的参与。属于PKSⅡ的聚酮化合物有放线紫红素（acti-norhodin，act）、四并菌素（tetracenomycinc，tcm）和富伦菌素（frenolicin，fren）等。
2.2.1放线紫红素。芳香族化合物PKSⅡ基因组合生物合成产物的原则是单个基因组合。以放线紫红素为例，其生物合成的途径是以乙酰CoA为起始，7个丙二酰CoA为延长单位，经PKS最小单位合成16碳链，其可以自发地环化形成中间产物，但在KR作用下第9位碳酮基被还原，并形成C7～C12环，在芳香酶的参与下形成第1个芳香环，然后再由环化酶催化形成第2个环，经后修饰形成放线紫红素。研究发现，ACP对链的长短不起作用，主要由CLF决定碳链长度，进一步研究表明，KS中54个残基和CLF共同决定碳链的长度。Ⅱ型PKS的机制不如Ⅰ型了解得透彻，Ⅱ型产物在结构多样性上比Ⅰ型更少。研究表明，许多芳香族聚酮化合物生物合成PKS基因簇中，均含有酮基还原酶KR基因，不论碳链长短（C8～C24），KR基因均可催化聚B-酮体C9位羰基的还原，说明PKSⅡ型酮基还原酶催化位点有区域特异性。但也有2个例外，在8-酮体和11-酮体中C7位羰基被还原。
2.2.2其他PKSⅡ型产物。近几年，国外研究者发现了其他几种微生物药物的生物合成酶基因簇也属于PKSⅡ型，这为进一步对其进行组合生物合成奠定了基础。
2.3PKSⅢ
PKSⅢ的典型为查尔酮合成酶（chalconesyn-thaw，CHS）类，是一种可重复使用的同源双亚基蛋白，在不需要ACP的情况下直接催化泛酞辅酶A间的缩合，其主要负责单环或双环芳香类聚酮化合物的生物合成，例如flavolin。
CHS属PKS，与脂肪酸及其他PKS相同，催化丙二酸单酞辅酶A的脱竣醇醛缩合。与其他PKS的最大差别在于直接以游离的丙二酸单酞辅酶A作底物，无论是PKSⅠ型或Ⅱ型均需要通过酞基转移酶4′-phosphopantetheine残基将丙二酸单酞辅酶A或其衍生物转移至KS上；另外，从酶的氨基酸序列来看，CHSs与其他PKSs和FASs均不相同。CHS以香豆酞基辅酶A为起始单元，以3分子的丙二酸单酞辅酶A作底物，连续完成3步脱羧醇醛缩合，其所生成的四酮经环化产生柚配基查耳酮（naringeninchalcone），该化合物为花青苷类色素（anthocyaninpigment）和植物黄酮（plan-tflavonoid）的前体。CHS基因最早从欧芹（parsley，Petroseli-numhortense）中克隆出来，该类仅分布于高等植物的PKS是一庞大的家族。不仅包括来源于被子植物和裸子植物的CHSs，还包括与CHSs相关的1，2-二苯乙烯合成酶（stil-benesynthases，STSs）。这2类酶的氨基酸序列有65%相同，并且合成相同的四酮。然而，S′I′Ss释放的四酮在环化时发生脱羧反应，从而生成与查耳酮不同的产物1，2-二苯乙烯。
尽管3类PKS存在结构和机制上的差异，但从本质而言均是由KS功能域（Ⅰ型）或蛋白亚基（Ⅱ或Ⅲ型）催化泛酞辅酶A间的脱羧―缩合反应以形成C―C键。基于PK天然产物的独特化学结构以及良好生物活性，研究其生物合成机制，为合理化遗传修饰生物的合成途径获得结构类似物提供遗传和生物化学的基础，以实现利用现代生物学与化学技术手段在微生物体内进行药物开发的目的。
3组合生物合成聚酮类化合物
组合生物合成（combinatorial biosynthesis）即通过基因工程的手段，有目的地改变自然产物的生物合成途径，其通过自然生物合成途径（生物体中）形成新结构的产物，这些人为产生的新结构化合物按照人们实验的预期表现出新的功能或活性。最早由Hopwood等证明了组合生物合成的可行性，他们克隆了抗生素actinorhodin的生物合成基因，并将其中的模块重组至抗生素medermycin和dihydrogranaticin的生物合成基因中，通过改造的生物合成途径得到了新化合物。
由于Ⅰ型PKS的结构特殊性，即基冈顺式构成了结构域和模块的二级组织方式，适合组合生物合成的研究。典型的Ⅰ型PKS是由催化亚单位即模块组成的大型酶复合物，多个模块按照线性装配线的形式排列。加载模块负责起始底物的加载和激活，然后每个延伸模块催化一步链的延伸反应，将延长单位加入链中。每个延伸模块至少包括3个催化区域，即：酮缩酶（ketosynthase，KS）负责催化双碳单位的缩合反应使聚酮链得以延长；酰基转移酶（acyltransferase，AT）负责底物选择、激活和转运；酰基载体蛋白（acyl carrier protein，ACP）结合延长的聚酮链。另外，还可能要加上的酮基还原酶（ketoreductase，KR）、脱氢酶（dehydratase，DH）和烯酰基还原酶（enoylreductase，ER）结构域等对聚酮链进行修饰。最后以负责碳链释放的硫脂酶（thioesterase，TE）结构域结束。通过有目的地对Ⅰ型PKS的各种模块重新编排、缺失、互换、失活等基因操作，形成的杂合PKS可催化产生新结构的聚酮化合物。例如通过组合生物合成改造的红霉素变体已有数十种。同时，由于模块型PKS结构和功能上的特点，聚酮化合物的组合生物合成现已经可以通过软件进行预测设计，如Zotchev等设计软件对大环内酯组合生物合成进行预测，使聚酮化合物的组合生物合成可以更理性地进行。
4结语
综上所述，聚酮化合物有许多优越性，例如其生物学活性使其具有巨大的新药物开发潜力和商业价值，聚酮化合物形成的药物已用于许多重要的疾病治疗，每年的销售额超过100亿美元；独特结构和合成机制为研究酶催化的分子机制、分子识别和蛋白质相互作用提供了很好的契机；聚酮合酶的可塑性可以使人们方便地通过组合生物合成手段获得新的化合物。聚酮化合物越来越被人们所重视，被广泛地应用于医药、畜牧和农业。可以预见，随着蛋白质工程的发展，改变酶的专一性可获得更多候选药物；如果更多合成酶被发现和利用，将有更多的结构多样性化合物产生，更多的非天然、天然药物将会应用于医疗领域，同时也可缓解目前抗生素耐药性问题。
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