食用色素为食品添加物功能分类下之重要着色剂，依来源不同可分为两大类：人工色素和天然色素，食用天然色素主要是从动植物细胞和微生物细胞中分离萃取而来。在天然食用色素里类胡萝卜素(Carotenoids)是一类呈现淡黄、橙色至深红色的天然色素。大部分约为四十个碳原子组成的多烯类化合物，主结构单元为异戊二烯，具有抗氧化特性、预防心血管疾病、增强免疫功能等生物活性 [1] ，依不同目的，常添加于动物饲料、保健食品、化妆品中。在目前日益重视食品、药品的天然、无毒、健康等要求下，天然类胡萝卜素的需求于全球市场上占一定重要性。
因近年来消费者对于合成色素的疑虑，使得食品工业渐渐以天然色素来取代合成色素 [2] 。一般情况下，天然色素多由植物材料萃取，而其他如昆虫、藻类、细菌、真菌亦为类胡萝卜素素的萃取来源 [3] 。其中，利用微生物发酵生产类胡萝卜素具营养需求简单、生长周期短、易调控生长条件、不受外在自然环境影响等优点 [4] ，使得利用微生物生产多样化色素之相关研究相继展开 [5] [6] 。故以微生物发酵法生产食用天然色素将可能成为色素食品添加物的重要来源。
目前已商业化生产类胡萝卜素之菌株，为三孢布拉霉菌(Blakeslea trispora) [7] 经研究证实无细胞毒性，是唯一在俄罗斯(Russia)、乌克兰(Ukraine)、西班牙(Spain)等国家先行实施工业化生产的菌株。但因发酵过程复杂在色素生产的过程上难度增加 [8] [9] 。故研究者陆续开发其他具有产类胡萝卜素潜力之微生物，以期降低培养过程中之生产成本和发酵问题。
研究从蔬果中分离纯化具产色能力的胶红酵母菌，以作为类胡萝卜素之生产来源。并进行生产类胡萝卜素最适化条件探讨以确立培养时间、pH值、温度、碳源、氮源，同时探讨变温逆境条件对生物量、色素含量、色素产量的影响。
2. 材料与方法
2.1. 材料
胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)菌株，本实验室由葡萄柚(Citrus paradisi)果实中纯化分离而得，以基因组中rDNA ITS区域片段设计之引子组ITS1与ITS4，对红色菌株DNA进行扩增。此引子放大片段大小为700 bp，将扩增定序出的DNA序列与GenBank数据库进行比对，与Rhodotorula mucilaginosa菌株达100%相似度。
2.2. 最适化培养
试验采用单因子设计探讨，将基础培养基PDB(Potato Dextrose Broth)的结果作为未调整之原条件，以作后续优化比较。
2.2.1. 最适收菌时间
接种0.1%经48小时活化培养之胶红酵母菌酛(yeast starter)至三角支架摇瓶中，依真菌培养基PDB (Potato Dextrose Broth)进行培养，设置回转式震荡恒温培养箱温度30℃、转速125 rpm，每隔12小时取样一次，进行吸光值OD600测定、菌体干重、培养基终pH值及色素含量测定，经上述分析结果，以求出最适收菌时间。
2.2.2. 最适培养温度
以22.5、25、27.5、30、32.5℃温度范围进行培养，每隔12小时取样一次，进行吸光值OD600测定、菌体干重、培养基终pH值及色素含量(Carotenoids content)测定。
2.2.3. 最适培养碳源
设定液态培养基之总体积为50 mL，分别以蔗糖(Sucrose)、乳糖(Lactose)、麦芽糖(Maltose)、果糖(Fructose)、葡萄糖(Glucose)、半乳糖(Galactose)作为碳源，碳源浓度皆为15 g/L。
2.2.4. 最适培养氮源
设定液态培养基之总体积为50 mL，分别以酵母萃取物(Yeast extract)、硫酸铵(Ammonium sulfate)作为氮源，氮源浓度皆为2.5 g/L。
2.3. 变温逆境探讨
2.3.1. 短时高温
以转速125 rpm，最适温度27.5℃将菌体培养至稳定期，给予6小时37.5℃高温刺激后，回复最适温度27.5℃培养，每隔12小时取样一次，进行吸光值OD600测定、菌体干重、培养基终pH值及色素含量测定。
2.3.2. 短时低温
以转速125 rpm，最适温度27.5℃将菌体培养至稳定期，给予6小时10℃低温刺激后，回复最适温度27.5℃培养，每隔12小时取样一次，进行吸光值OD600测定、菌体干重、培养基终pH值及色素含量测定。
2.3.3. 持续低温
以最适温度 27.5℃将菌体培养至稳定期，持续给予22.5℃低温培养直至收菌完成。
2.4. 生物量测定
菌液进行离心(9,500 rpm, 4℃, 10 min)，分离上清液，以ddH2O轻轻润洗菌块，倒去润洗菌块水，注入绝对酒精使菌块表面剩余水分挥发，将菌块放至-80˚C 冷冻隔夜，以冷冻干燥机冻干后秤得菌体干重。
生物量(Biomass)(g/L) = 菌体干重(g)/培养基(L)
2.5. 色素萃取
依据Michelon等人利用DMSO与丙酮进行萃取 [10] 。DMSO可提升细胞通透性，均质震荡一小时，进行离心(10,000 rpm, 4 ℃, 10 min)，收集上清液至新的离心管，若胶红酵母细胞沉淀物(pellet)尚有颜色，则再注入新的DMSO。纪录所添加DMSO的量，重复上述步骤直至菌块呈现微白透明。
2.6. 色素含量测定
将所萃取出之色素取200 μL至96 well flat-bottom microtiters plates中，分析475 nm波长下之吸光值，依数值代入公式，即为色素含量
Carotenoid yield (μg/g of dry yeast) = (Aλ
