（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省科学院生物研究所，山东济南250103；2.山东师范大学生命科学院，山东济南250014）
摘 要：β-胡萝卜素具有较强的抗氧化活性，三孢布拉霉（Blakeslea trispora）是β-胡萝卜素的高产菌株。以发酵三孢布拉霉菌株提取的β-胡萝卜素为研究对象，采用DPPH（对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）法，测定自由基清除率，对β-胡萝卜素抗氧化活性进行研究。考察在不同温度下，不同浓度的β-胡萝卜素抗氧化活性的不同，计算了相关动力学数据：活性半数效应浓度（EC50）、表观活化能（Ea）和反应速率常数（k）。结果表明，相同浓度下，β-胡萝卜素在37℃抗氧化活性达到平衡的时间为30 min，短于25℃时45 min的平衡时间，说明温度越高，反应速度越快；在相同温度下，β-胡萝卜素浓度越高，抗氧化活性越强，当浓度达到160 μg/mL时，达到70.77%的清除效率。同时，通过计算可得，随反应温度的升高，反应速率常数k增大，说明反应温度对β-胡萝卜素抗氧化活性有较大影响，但不同质量浓度的Ea稳定在31kJ/mol左右，没有显著性差异，说明起始浓度对活性没有影响。
关键词：三孢布拉霉；β-胡萝卜素；抗氧化活性
体内自由基在信号传导等方面具有一定功能，但过多的自由基易导致人体细胞损伤，从而引发癌症、肿瘤等疾病[1-3]。β-胡萝卜素广泛存在于蔬菜、水果中[4]，可以清除人体内的自由基，是一类重要的天然抗氧化剂，能够有效提高机体的免疫功能[5-8]。三孢布拉霉发酵法是目前国际上大规模生产天然β-胡萝卜素的最佳方法，改进发酵和提取工艺能够有效提高β-胡萝卜素含量[9-12]。目前，对来源于微生物发酵β-胡萝卜素的主要研究集中在提高产量方面，缺乏对其抗氧化动力学的系统研究，而动力学研究是对β-胡萝卜素抗氧化活性机理研究的前提基础[13]。因此，对三孢布拉霉产β-胡萝卜素抗氧化活性动力学研究具有重要意义。
本文采用DPPH法测定从三孢布拉霉菌株中提取的β-胡萝卜素清除自由基的活性，进而通过计算获得相应动力学参数，确定不同质量浓度的β-胡萝卜素在不同的反应温度和反应时间条件下清除DPPH自由基能力的变化，为下一步对β-胡萝卜素抗氧化活性的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
三孢布拉霉（Blakeslea trispora）正（+）菌株、负（-）菌株：山东省科学院生物所工业微生物科室保藏。
β-胡萝卜素标准品：Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：梯希爱（上海）化成发展有限公司；无水乙醇、石油醚等试剂均为国产分析纯；试验用水为超纯水。
种子培养基：玉米粉2.5%，黄豆粉5%，VB10.000 5%。发酵培养基：玉米粉1.8%，葡萄糖0.48%，黄豆粉3.00%，玉米浆粉0.075%，MgSO4·7H2O 0.10%，KH2PO40.2%，
植物油5%。
1.2 仪器与设备
UNICO UV-2100紫外分光光度计：上海贺德实验设备有限公司；CS601电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司；LE204E/02电子天平：梅特勒托利多集团；N-1110V-WD旋转蒸发仪：东京理化器械株式会社；FD-1冷冻干燥机：北京德天佑科技发展有限公司；HZQ-QX温控摇床：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；DNP-9082恒温恒湿培养箱：上海精宏实验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 三孢布拉霉菌株发酵产β-胡萝卜素
在无菌条件下，从斜面保存的三孢布拉霉原始正、负菌株取一定大小的菌苔，分别置于内装25 mL种子培养基的灭菌后的250 mL锥形瓶中，27℃，180 r/min，摇床培养，其中负菌培养60 h，正菌培养48 h。而后，将正负菌株同时转接到内装50 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，转接正、负菌株菌种比例为1∶4，27℃，180 r/min，摇床培养120 h。
1.3.2 β-胡萝卜素提取及含量测定
将β-胡萝卜素标准品溶解于乙酸乙酯，分别配制浓度为 0、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL 样品，使用分光光度计于450 nm处测定吸光值，绘制标准曲线。
收集发酵菌液，离心去除上清，菌体蒸干水分，准确称量，按照参考文献[14]方法进行提取，测定450 nm吸光值，通过标准曲线计算β-胡萝卜素含量，备用。
1.3.3 β-胡萝卜素抗氧化活性动力学参数测定
配制质量浓度分别为 80、100、120、140、160 μg/mL的β-胡萝卜素溶液，并称取DPPH 0.019 7 g，用无水乙醇溶解并定容至50 mL作储备液。取DPPH储备液10 mL稀释成100 μmol/L DPPH自由基工作液（现配现用）。将1 mL样品与3 mL 100 μmol/L DPPH自由基工作液混匀，分别在37℃和25℃下反应不同时间，于517 nm波长处测定吸光度。以DPPH自由基清除率（α）和半数效应浓度EC50评估β-胡萝卜素样品清除自由基的能力，按下式计算DPPH自由基清除率。
式中：A为DPPH自由基清除率，%；Ai为加入β-胡萝卜素时溶液的吸光度；Aj为β-胡萝卜素溶液在测定波长处的吸光度；A0为未加β-胡萝卜素时溶液的吸光度。
1.3.4 数据处理
运用SPSS软件进行统计分析，所有试验均重复3次。
2 结果与讨论
2.1 三孢布拉霉菌株发酵产β-胡萝卜素
三孢布拉霉，有正菌和负菌两种菌，负菌产β-胡萝卜素能力强，正菌产β-胡萝卜素能力弱，正菌和负菌一起融合后，产生三孢酸，诱导β-胡萝卜素合成。负菌为主要的生产菌，而正菌在β-胡萝卜素合成过程中起着一定的诱导作用。相对正菌，负菌更容易退化。因此，以三孢布拉霉负菌为出发菌株，进行定向传代选育。
将待筛选的三孢布拉霉负菌与正菌进行混合培养，摇瓶发酵，生产β-胡萝卜素。通过分步提取，获得纯度较高的β-胡萝卜素。通过标准曲线测定β-胡萝卜素含量，计算所得产量，如表1所示。
表1 不同菌株β-胡萝卜素产量对比
Table 1 The yield of β-carotene from different strains
根据试验结果，4号菌株菌体干重为66.23 g/L，β-胡萝卜素生物合成量为2.44 g/L，在筛选菌种中为最优，因此挑选三孢布拉霉负菌4号菌株为最终目标菌株，与正菌混合培养发酵。同时，优化发酵条件，通过加入不同剂量的植物油使菌株菌丝分散，加速菌株生长繁殖。确定最终种子培养基和发酵培养基配方，获得菌株后，通过提取，获得β-胡萝卜素，取部分样品进行含量测定，其余备用。
2.2 反应温度及β-胡萝卜素质量浓度对β-胡萝卜素抗氧化活性的影响
图1 温度对β-胡萝卜素清除DPPH自由基的影响
Fig.1 Effect of temperature on the kinetics of scavenging DPPH radical by β-carotene
使用提取的β-胡萝卜素进行试验，以对DPPH自由基清除率为抗氧化活性指标。结果如图1所示，A～E分别表示 β-胡萝卜素质量浓度为 80、100、120、140、160 μg/mL时，反应温度分别在37℃和25℃条件下，β-胡萝卜素清除DPPH自由基清除率曲线。
图2中A、B分别表示反应温度分别为37℃和25 ℃时，不同质量浓度（80、100、120、140、160 μg/mL）的β-胡萝卜素清除DPPH自由基的清除率曲线。
图2 β-胡萝卜素质量浓度对清除DPPH自由基的影响
Fig.2 Effect of concentration on the kinetics of scavenging DPPH radical by β-carotene
由图1、图2可见，温度和初始质量浓度都对β-胡萝卜素清除DPPH自由基有影响。同一质量浓度的β-胡萝卜素在不同温度下，反应达到平衡的时间不同。37℃时，反应达到平衡的时间约为30 min，而25℃时，（45±2）min时反应结束；温度对β-胡萝卜素清除DPPH自由基的速率（k）影响显著（P<0.05），而对清除率（α）无显著影响。同一反应温度下，随着β-胡萝卜素质量浓度的不断提高，其清除DPPH自由基的能力逐渐加强，表明在一定范围内β-胡萝卜素清除DPPH自由基的能力与其浓度呈明显的量效关系。因此要探讨初始质量浓度和反应温度对β-胡萝卜素清除DPPH自由基活性的变化规律。
2.3 β-胡萝卜素清除DPPH自由基活性半数效应浓度的测定
不同反应温度下β-胡萝卜素对DPPH自由基的清除曲线见图3。
图3 不同反应温度下β-胡萝卜素对DPPH自由基的清除曲线
Fig.3 Scavenging curves of DPPH radical by β-carotene under different reaction temperatures
如图3所示，不同反应温度下，80μg/mL～160μg/mL范围内随着β-胡萝卜素浓度的升高，清除率均增大。当反应进行到30 min时，37℃下反应达到平衡，最大清除率达到70.77%；25℃下反应尚未结束，最大清除率为55.80%。表2为不同反应温度条件下反应进行到30 min时，β-胡萝卜素清除DPPH自由基动力学的回归方程及EC50，由表2可以得出反应温度对EC50影响显著（P<0.05），且EC50（37℃）<EC50（25℃）。
表2 β-胡萝卜素清除DPPH自由基动力学的回归方程及EC50
Table 2 Regression equation and EC50of scavenging kinetics of DPPH radical by β-carotene
注：*表示差异显著（P<0.05）。
2.4 β-胡萝卜素抗氧化动力学参数分析
假设β-胡萝卜素在不同温度下清除DPPH自由基的速率符合一级或二级反应动力学模型，将所测定的消除数据进行分析[15]。以160 μg/mL组为例，分别以ln（1-α）-t和1/（1-α）-t作图，结果如图4所示。
图4 一级、二级反应动力学方程拟合结果
Fig.4Kinetic curves of ln（1-α）-t and 1/（1-α）-t
由图4可知，在反应温度37℃和25℃条件下，ln（1-α）-t拟合曲线的 R2分别为 0.995 6 和 0.990 7；1/（1-α）-t拟合曲线的R2分别为0.977 8和0.977 0。ln（1-α）-t拟合曲线的R2高于1/（1-α）-t拟合曲线的R2，即一级动力学模型拟合的线性相关性较好。同时，其余4组浓度均可得出相同结论。由此可见，β-胡萝卜素清除DPPH自由基的反应动力模型符合一级反应，可由公式 ln（1-α）=-kt求得反应速率常数k，式中：α表示DPPH自由基清除率，t为反应时间，min；k为拟一级反应速率常数，mg/（mL·min）。
根据阿仑尼乌斯公式 k=K0·exp（－Ea/RT），式中：k为反应速率常数；K0为方程常数；Ea为表观活化能，kJ/mol；R为气体常数，8.314 dm3·kPa/（K·mol）；T为绝对温度，K[16]，对方程两边同时取对数，得到公式lnk=－Ea/RT+lnK0。以lnk对1/T绘制曲线，通过曲线的斜率和截距即可得到Ea的值，见表3。
表3 β-胡萝卜素抗氧化动力学参数
Table 3 Parameters for antioxidant kinetics of β-carotene
随反应温度的升高，反应速率常数k增大，说明温度升高，反应速度加快，升温有利于反应的进行；不同质量浓度的Ea差异不显著，说明Ea不受初始质量浓度C0的影响。
3 结论
本研究通过培养发酵三孢布拉霉菌株生产β-胡萝卜素，并对β-胡萝卜素进行提取，以其为研究对象，采用DPPH法测定β-胡萝卜素自由基清除率，考察了不同温度条件下，不同浓度的β-胡萝卜素抗氧化活性的不同，为充分开发利用这一天然资源提供科学依据。结果表明，相同浓度下，β-胡萝卜素在37℃抗氧化活性达到平衡的时间为30 min，短于25℃时45 min的平衡时间，说明温度越高，反应速度越快；在相同温度下，β-胡萝卜素浓度越高，抗氧化活性越强，当浓度达到160 μg/mL时，能够达到70.77%的清除效率。同时，通过计算可得，随反应温度的升高，反应速率常数K增大，说明反应温度对β-胡萝卜素抗氧化活性有较大影响，温度升高，反应速度加快，升温有利于反应的进行，但不同质量浓度的Ea稳定在31 kJ/mol左右，没有显著性差异，说明β-胡萝卜素起始浓度对抗氧化活性没有显著影响。β-胡萝卜素具有优良的清除自由基的能力，在保健食品和医药工业等方面应用前景广阔，此研究为β-胡萝卜素功能产品的研究和开发提供理论基础，可以进一步深入系统的进行探讨。
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