苯乙酮转化为(S)-α-苯乙醇的工程菌构建

贾振华1 , 刘昱1 , 李冉1 , 陈曦2 , 张红榴2 , 吴洽庆2 , 宋水山1     

摘要：
【背景】 (S)-a-苯乙醇是一种重要的药物合成中间体，利用工程菌将苯乙酮转化为(S)-α-苯乙醇的方法具有立体选择性强、转化条件温和等优势，该研究对未来绿色工业化生产有重要意义。
【目的】 构建能将苯乙酮转化为(S)-α-苯乙醇的工程菌并对其转化条件进行研究。
【方法】 分别从红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)中克隆得到羰基还原酶基因ReADH以及甲酸脱氢酶基因FDH，构建pRSFDuet-ReADH-FDH (R1F2)和pRSFDuet-FDH-ReADH (F1R2)两个共表达载体，分别在大肠杆菌中表达。测定R1F2和F1R2中ReADH和FDH酶活性及其催化反应的最适反应条件。对利用全细胞转化苯乙酮为(S)-α-苯乙醇反应条件进行研究。
【结果】 构建了R1F2和F1R2两个共表达载体，其中R1F2中ReADH和FDH的酶活性分别为6.7 U/mL和7.6 U/mL，对苯乙酮有更强的催化还原能力。R1F2中ReADH和FDH的最适pH分别为6.0和8.5，最适温度分别为40 ℃和35 ℃。R1F2全细胞转化苯乙酮反应的最适pH和温度分别为7.5和30 ℃，对高底物有较强耐受性，对400 mmol/L苯乙酮转化率大于98%，产物(S)-α-苯乙醇的光学纯度大于99%。
【结论】 研究获得的工程菌及其全细胞转化条件为工业应用奠定了基础。

关键词：羰基还原酶     甲酸脱氢酶     共表达     生物转化     (S)-a-苯乙醇    

Construction of engineering bacteria for conversion of acetophenone to (S)-α-phenylethanol

JIA Zhen-Hua1, LIU Yu1, LI Ran1, CHEN Xi2, ZHANG Hong-Liu2, WU Qia-Qing2, SONG Shui-Shan1     

Abstract: [Background] (S)-α-phenylethanol is a kind of important pharmaceutical intermediate. Conversion of acetophenone into (S)-α-phenylethanol by engineering bacteria has the advantages of strong stereoselectivity and mild transformation conditions. The study of this synthetic method is of great significance for the future green industrial production. [Objective] Construction of engineering bacteria capable of transforming acetophenone into (S)-α-phenylethanol, and the study on its transformation conditions. [Methods] ReADH gene encoding carbonyl reductase and FDH gene encoding formate dehydrogenase were cloned from Rhodococcus erythropolis and Candida boidinii, respectively. The constructed pRSFDuet-ReADH-FDH (R1F2) and pRSFDuet-FDH-ReADH (F1R2) were transformed into Escherichia coli, respectively. The enzymatic assay of ReADH and FDH were analyzed. The optimized transformation conditions to produce (S)-α-phenylethanol were tested. [Results] The enzyme activity of ReADH and FDH in R1F2 were 6.7 U/mL and 7.6 U/mL, respectively. R1F2 had higher catalytic activity than F1R2. The optimum pH of ReADH and FDH were 6.0 and 8.5, respectively. The optimum temperature of the ReADH and FDH were 40 ℃ and 35 ℃, respectively. The optimum pH and temperature for the reaction of acetophenone catalyzed by R1F2 is 7.5 and 30 ℃. R1F2 co-expression strain could catalyze the reduction of acetophenone with high substrate concentration, the conversion of 400 mmol/L acetophenone was over 98%, and the e.e. of (S)-α-phenylethanol value was over 99%. [Conclusion] Conversion of acetophenone into (S)-α-phenylethanol by engineered strain has a good prospect for industrial application.

Keywords: Carbonyl reductase     Formate dehydrogenase     Co-expression     Biotransformation     (S)-α-phenylethanol    

(S)-α-苯乙醇是一种用于合成多类药物的手性中间体。它作为免疫增强剂左旋咪唑、治疗哮喘的药物(S)-异丙肾上腺素、抗抑郁药物取舍林等药物合成的前体，具有很高的应用价值[1-3]。羰基还原酶是生物合成(S)-α-苯乙醇中的一种关键酶，存在于酵母、细菌和高等动植物中[4-6]。该酶具有高度的化学、区域和立体选择性，常用于手性化合物的生物合成[7-8]。

羰基还原酶在催化反应中通常需要辅酶NAD(P)H的参与，但是这类辅酶价格昂贵，以还原酶与氧化酶共表达为主的辅酶再生方法成为降低反应成本的有效途径[9-11]。例如在L-叔亮氨酸的合成中，利用甲酸脱氢酶实现了辅酶的循环利用[12-13]；葡萄糖脱氢酶也被应用于辅酶再生，并用于1-苯基-2-甲氨基丙酮转化为D-伪麻黄碱的合成[14]。

目前对微生物制备(S)-α-苯乙醇的研究较少，有研究者从土壤中筛选到具有转化能力的菌株[15]，未见到利用基因工程手段将关键酶基因高效表达获得目标物的研究。本研究分别从红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)中克隆得到羰基还原酶基因(ReADH)和甲酸脱氢酶基因(FDH)，构建了ReADH与FDH的共表达菌株，研究其酶学性质并对全细胞转化法制备(S)-α-苯乙醇的条件进行了摸索，以期为(S)-α-苯乙醇的绿色工业化生产提供依据。

1 材料与方法 1.1 菌株与质粒

大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、E. coli BL21(DE3)，美国英杰生命技术有限公司；pRSFDuet-1、pET28a-ReADH、pET21d-FDH由本实验室保藏。

1.2 主要试剂和仪器

KOD Plus DNA聚合酶，东洋纺(上海)生物科技有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA分子量标准、蛋白分子量标准，赛默飞世尔科技有限公司；Plasmid Mini Kit Ⅰ、Gel Extraction Kit、Cycle-Pure Kit，Omega Bio-Tek公司；ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit，南京诺唯赞生物科技有限公司。

Mastercycler nexus GSX1梯度PCR仪，艾本德股份公司；PowerPac BasicTM型电泳仪，伯乐公司；SpectraMax® M2多功能酶标仪，美谷分子仪器(上海)有限公司；高效液相色谱1200，安捷伦科技有限公司。

1.3 共表达工程菌的构建

以实验室构建的质粒pET28a-ReADH及pET21d-FDH为模板，利用设计的ReADH、FDH基因引物(表 1)进行PCR扩增，使其序列两端分别带有Nco Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点，分别连入pRSFDuet-1第一个读码框。PCR反应体系(50 μL)：KOD Plus DNA聚合酶(1 U/μL) 1 μL，dNTPs (2 mmol/L) 5 μL，MgSO4 (25 mmol/L) 2 μL，10×PCR buffer 5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各1.5 μL，模板DNA 0.2 μL，超纯水33.8 μL。PCR反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。ReADH、FDH连入pRSFDuet-1第二个读码框的方法参照南京诺唯赞生物科技有限公司的One Step Cloning Kit使用说明书。重组质粒转化E. coli DH5α感受态，通过菌液PCR鉴定阳性转化子并测序验证。测序正确的重组载体分别命名为pRSFDuet-ReADH-FDH (R1F2)和pRSFDuet-FDH-ReADH (F1R2)并转化至E. coli BL21(DE3)感受态。

1.4 共表达工程菌的重组表达

挑取含有R1F2和F1R2重组质粒的E. coli BL21(DE3)单菌落，接种至LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中，于37 ℃、200 r/min培养12 h。以0.1%的接种量转接到800 mL LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)，置于3 L摇瓶中37 ℃培养至OD600值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1 mmol/L IPTG，20 ℃诱导12 h，4 ℃、12 000 r/min离心5 min收集菌体。按菌体浓度100 mg/mL将菌体重悬于磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(50 mmol/L，pH 7.5)，置于冰水浴中，超声波功率为200 W进行细胞破碎，此为全细胞破碎液。将全细胞破碎液4 ℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清即为粗酶液。分别收集全细胞破碎液及粗酶液进行SDS-PAGE分析。

1.5 酶活性测定及酶学性质

ReADH反应体系：50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)，10 mmol/L苯乙酮，0.5 mmol/L NADH及10 μL粗酶液，总体积为200 μL。粗酶液加入不含NADH的反应体系，37 ℃水浴15 min，加入NADH起始反应，利用紫外分光光度计在340 nm处测定其1 min吸光值的变化。FDH反应体系：50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)，20 mmol/L甲酸钠，0.5 mmol/L NAD+及10 μL粗酶液，总体积为200 μL。粗酶液加入不含NAD+的反应体系，37 ℃水浴15 min，加入NAD+起始反应，利用紫外分光光度计在340 nm处测定其1 min吸光值的变化。酶活性定义：在上述条件下，1 min催化生成1 μmol NAD(H)的酶量定义为1个酶活力单位。

酶活性计算公式：

其中，EW：1 min内340 nm处吸光值的变化；V1：反应液体积；V2：粗酶液体积。

最适pH测定。将1.5所述反应体系的缓冲液分别换成50 mmol/L柠檬酸/柠檬酸钠(pH 3.0-6.5)、50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾(pH 6.0-8.0)、50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5-9.0)、50 mmol/L甘氨酸/氢氧化钠(pH 8.5-10.5)，分别测定共表达菌株中表达的ReADH和FDH的酶活性，以酶活性达到最高时作为100%，计算不同pH下的相对酶活性。每个处理重复3次。

最适温度测定。将上所述反应体系分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃测定共表达菌株中表达的ReADH与FDH的酶活性，以酶活性达到最高时作为100%，计算不同温度下的相对酶活性。每个处理重复3次。

1.6 苯乙酮不对称还原反应及高效液相色谱检测

苯乙酮反应体系：50 mmol/L磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.5)中加入终浓度100 mmol/L苯乙酮(10% DMSO助溶)，0.5 mg/mL NAD+，300 mmol/L甲酸钠，ReADH酶活为1 U/mL的共表达菌R1F2或F1R2全细胞，总体积为1 mL。30 ℃、200 r/min反应24 h。取1 mL反应液加入等体积乙酸乙酯萃取，涡旋振荡3 min，14 000 r/min离心2 min。收集上层有机相风干后复溶于等体积90%正己烷和10%异丙醇混合溶液中，涡旋振荡后过0.22 μm有机膜，用高效液相色谱(HPLC)检测。

HPLC检测使用CHIRALCEL® OD-H柱子，流动相为90%正己烷+10%异丙醇，流速：0.8 mL/min，柱温：30 ℃，可变波长扫描紫外检测器(VWD)检测波长为220 nm。根据峰面积计算苯乙酮的转化率及产物(S)-α-苯乙醇的光学纯度。

1.7 共表达菌株的转化条件

 

1.7.1 转化反应的最适pH

将1.6所述反应体系中的缓冲液分别换成柠檬酸/柠檬酸钠(pH 3.0-6.5)、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾(pH 6.0-8.0)、Tris-HCl (pH 7.5-9.0)、甘氨酸/氢氧化钠(pH 8.5-10.5)。反应2 h后，利用HPLC检测各pH下苯乙酮的转化率，以转化率最高点作为100%，计算不同pH下的相对转化率，确定其反应最适pH值。每个处理重复3次。

 

1.7.2 转化反应的最适温度

将1.6所述反应体分别在20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃水浴2 h。利用HPLC检测各温度下苯乙酮的转化率，以转化率最高点作为100%，计算不同温度下的相对转化率，确定其反应最适温度。每个处理重复3次

 

1.7.3 底物浓度耐受性

将1.6所述反应体系中的苯乙酮浓度分别设为100、200、400、500 mmol/L，并将反应体系扩大至50 mL。在反应第2、4、6、8、12、24、36 h取样，利用HPLC检测并计算苯乙酮转化率。每个处理重复3次。

2 结果与分析 2.1 共表达菌株的构建及验证

ReADH和FDH基因开放阅读框大小分别为1 047 bp和1 101 bp。将ReADH和FDH基因按不同顺序分别连入pRSFDuet-1共表达载体的2个读码框中，载体构建示意图如图 1所示。将构建好的重组质粒转入E. coli DH5α克隆菌株，对阳性菌落进行菌液PCR鉴定，扩增得到2 200 bp左右的片段(图 2)，将测序正确的重组质粒转入E. coli BL21 (DE3)进行诱导表达。

2.2 重组蛋白的诱导表达

将2株工程菌R1F2、F1R2分别培养并诱导表达，取全细胞破碎液及粗酶液进行SDS-PAGE分析。如图 3所示，这2株工程菌均有胞内可溶性蛋白表达，其大小为42 kD。因ReADH与FDH分子量相差不大，因此在SDS-PAGE结果中没有分离出2条明显的蛋白条带。由图 3结果也可知，菌株F1R2表达的蛋白量较少。

2.3 ReADH和FDH的酶学性质

 

2.3.1 ReADH和FDH的催化活性

为了检测工程菌表达的ReADH和FDH是否具有酶活性，将诱导后的工程菌R1F2和F1R2分别重悬至菌体浓度为100 mg/mL，超声破壁后测定粗酶液酶活性，结果表明ReADH和FDH均有催化活性，且R1F2中2种酶催化活性较高(表 2)。

 

2.3.2 pH对ReADH和FDH酶活性的影响

为了检测ReADH和FDH酶活性是否受反应体系中pH变化的影响，在不同pH缓冲液中测定了R1F2粗酶液中ReADH和FDH的酶活性，发现pH对ReADH和FDH的酶活性影响很大，其中ReADH的最适pH为6.0，FDH的最适pH为8.5 (图 4)。

 

2.3.3 温度对ReADH和FDH酶活性的影响

在不同反应温度下检测R1F2粗酶液中ReADH和FDH的酶活性，发现ReADH的最适反应温度为40 ℃，FDH的最适反应温度为35 ℃。当温度 > 60 ℃时，ReADH和FDH基本失去酶活性(图 5)。

2.4 全细胞转化与产物检测

根据表 2结果计算反应体系中R1F2和F1R2全细胞的添加量，反应24 h后利用HPLC检测R1F2和F1R2的反应液，结果如图 6所示，在6.620 min出现底物峰为苯乙酮，8.594 min时出现产物峰为(S)-α-苯乙醇。根据峰面积计算苯乙酮转化率及光化学纯度e.e.值(表 3)，结果表明共表达菌株R1F2对苯乙酮的转化效果较好，转化率 > 96%且e.e.值> 99%，使用该共表达菌株进行苯乙酮转化条件的研究。

2.5 全细胞转化条件

 

2.5.1 不同pH下苯乙酮的转化率

因串联表达的2个酶最适pH相差较大，为确定全细胞转化苯乙酮反应的最适pH，将R1F2全细胞在不同pH条件下进行反应，检测到R1F2对苯乙酮的转化率达到最高时的pH为7.5 (图 7)。

 

2.5.2 不同温度下苯乙酮的转化率

为确定温度对全细胞转化苯乙酮反应的影响，将R1F2全细胞反应体系置于不同温度条件下反应，测定结果表明，在20-30 ℃时苯乙酮的转化率逐渐增加，当温度超过30 ℃时苯乙酮转化率开始下降。利用全细胞转化苯乙酮为(S)-α-苯乙醇的最适温度为30 ℃ (图 8)。

 

2.5.3 底物浓度耐受性

在50 mL反应体系中分别加入浓度为100、200、400、500 mmol/L的苯乙酮，检测反应不同时间时R1F2对苯乙酮的转化率(图 9)。结果表明，底物浓度分别为100、200 mmol/L时，反应12 h转化率达99%；底物浓度为400 mmol/L时，反应24 h产物含量为385 mmol/L，对底物的转化率可达98%；当底物浓度为500 mmol/L时，反应36 h产物含量为425 mmol/L，对底物的转化率为85%。综合上述结果并结合生产实际考虑，苯乙酮浓度为400 mmol/L，反应24 h的反应条件较为理想。

3 讨论与结论

羰基还原酶与辅酶再生循环相关酶的共表达体系已成为降低生物合成成本的一种有效手段，被广泛应用于醇类手性化合物的合成。孙莹等从近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)中克隆得到(R)-羰基还原酶基因RCR，并与甲酸脱氢酶基因FDH共表达，用于(R)-苯基乙二醇的合成[16]。随后，姜佳伟等从近平滑假丝酵母中克隆得到(S)-羰基还原酶基因SCR，并与葡萄糖脱氢酶基因ADH共表达用于合成(S)-苯基乙二醇，底物转化率和产物光学纯度均大于99%[17]。前期有关于酶共表达体系用于合成(R)-苯乙醇的报道，Weckbecker等将嘧啶核苷转氢酶基因PNT、醇脱氢酶基因ADH和甲酸脱氢酶基因FDH共表达，可使66%苯乙酮转化为(R)-苯乙醇[18]。Yun等将ε-转氨酶、醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶组成的共表达体系可将50% α-甲基苄胺转化为(R)-苯乙醇，光学纯度大于99%[19]。目前未有关于酶共表达体系用于合成(S)-α-苯乙醇的报道。

本研究分别从红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)中克隆得到羰基还原酶基因(ReADH)和甲酸脱氢酶基因(FDH)，以不同顺序串联于pRSFDuet-1载体中，实现了两个酶的高效共表达，可用于(S)-α-苯乙醇的合成。有研究结果表明，ReADH为NADH依赖型[20]，因此在辅酶再生循环中采用甲酸脱氢酶FDH进行共表达，以稳定反应pH，降低副反应产物。ReADH和FDH的酶活性测定结果表明，R1F2中ReADH和FDH催化活性高于F1R2，这可能与活性测定使用的是粗酶液，且两者目的蛋白表达量有差异有关。全细胞转化条件研究结果表明，反应最适pH和温度分别为7.5和30 ℃，pH介于两个酶体外活性最适pH之间，温度与FDH体外活性最适温度接近；在最适反应条件下，R1F2菌株可以对较高浓度的苯乙酮进行转化，反应24 h对400 mmol/L苯乙酮转化率大于98%，且(S)-α-苯乙醇的光化学纯度大于99%，该反应条件是否适用于(S)-α-苯乙醇的大量生产有待进一步验证。

对于工业应用而言，实现NAD+在催化反应中的循环利用对降低成本效果显著[11]。本研究构建的共表达体系实现了NADH的再生并用于(S)-α-苯乙醇的生物合成，为工业化应用中酶促反应的连续进行提供了一个有效技术手段，为后续建立大规模生产的工业化体系提供了参考。

参考文献

[1]	Du PX, Wei P, Lou WY, et al. Biocatalytic anti-Prelog reduction of prochiral ketones with whole cells of Acetobacter pasteurianus GIM1.158[J]. Microbial Cell Factories, 2014, 13: 84. DOI:10.1186/1475-2859-13-84
[2]	Ni Y, Xu JH. Biocatalytic ketone reduction: a green and efficient access to enantiopure alcohols[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(6): 1279-1288. DOI:10.1016/j.biotechadv.2011.10.007
[3]	Pollard DJ, Woodley JM. Biocatalysis for pharmaceutical intermediates: the future is now[J]. Trends in Biotechnology, 2007, 25(2): 66-73.
[4]	Forrest GL, Gonzalez B. Carbonyl reductase[J]. Chemico-Biological Interactions, 2000, 129(1/2): 21-40.
[5]	Ema T, Yagasaki H, Okita N, et al. Asymmetric reduction of ketones using recombinant E. coli cells that produce a versatile carbonyl reductase with high enantioselectivity and broad substrate specificity[J]. Tetrahedron, 2006, 62(26): 6143-6149. DOI:10.1016/j.tet.2006.04.061
[6]	Yasohara Y, Kizaki N, Hasegawa J, et al. Molecular cloning and overexpression of the gene encoding an NADPH-dependent carbonyl reductase from Candida magnoliae, involved in stereoselective reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2000, 64(7): 1430-1436. DOI:10.1271/bbb.64.1430
[7]	Schoemaker HE, Mink D, Wubbolts MG. Dispelling the myths--biocatalysis in industrial synthesis[J]. Science, 2003, 299(5613): 1694-1697. DOI:10.1126/science.1079237
[8]	Schmid A, Dordick JS, Hauer B, et al. Industrial biocatalysis today and tomorrow[J]. Nature, 2001, 409(6817): 258-268. DOI:10.1038/35051736
[9]	Betancor L, Berne C, Luckarift HR, et al. Coimmobilization of a redox enzyme and a cofactor regeneration system[J]. Chemical Communications, 2006(34): 3640-3642. DOI:10.1039/b604689d
[10]	Liu WF, Wang P. Cofactor regeneration for sustainable enzymatic biosynthesis[J]. Biotechnology Advances, 2007, 25(4): 369-384.
[11]	Yu HL, Huang L, Ni Y, et al. Advances in synthesis of chiral alcohols by carbonyl bioreduction[J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2013, 11(3): 71-82. (in Chinese) 郁惠蕾, 黄磊, 倪燕, 等. 羰基生物还原法合成手性醇的研究进展[J]. 生物加工过程, 2013, 11(3): 71-82. DOI:10.3969/j.issn.1672-3678.2013.03.013
[12]	Bommarius AS, Schwarm M, Drauz K. Biocatalysis to amino acid-based chiral pharmaceuticals-examples and perspectives[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 1998, 5(1/4): 1-11.
[13]	Bommarius AS, Drauz K, Hummel W, et al. Some new developments in reductive amtnation with cofactor regeneration[J]. Biocatalysis, 2009, 10(1/4): 37-47.
[14]	Yuwen WG, Zhang L, Wang ZX, et al. Co-expression of glucose dehydrogenase and carbonyl reductase in Escherichia coli and its application in asymmetric synthesis of d-ψ-ephedrine[J]. Industrial Microbiology, 2010, 40(3): 19-24. (in Chinese) 宇文伟刚, 张梁, 王正祥, 等. 羰基还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达及其在不对称还原产麻黄碱中的初步应用[J]. 工业微生物, 2010, 40(3): 19-24. DOI:10.3969/j.issn.1001-6678.2010.03.004
[15]	Li C, Qi NC, Peng G, et al. Screening and identification of S-phenylethanol-producing strain[J]. Journal of Microbiology, 2013, 33(2): 43-47. (in Chinese) 李成, 戚南昌, 彭果, 等. S-苯乙醇高产菌株的筛选及鉴定[J]. 微生物学杂志, 2013, 33(2): 43-47.
[16]	Sun Y, Zhang RZ, Xu Y. Co-expression of formate dehydrogenase form Candida boidinii and (R)- specific carbonyl reductase form Candida parapsilosis CCTCC M203011 in Escherichia coli[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2008, 48(12): 1629-1633. (in Chinese) 孙莹, 张荣珍, 徐岩. (R)-专一性羰基还原酶与甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达[J]. 微生物学报, 2008, 48(12): 1629-1633. DOI:10.3321/j.issn:0001-6209.2008.12.010
[17]	Jiang JW, Zhang RZ, Zhou XT, et al. Efficient biosynthesis of (S)-1-phenyl-1, 2-ethanediol catalyzed by (S)-carbonyl reductase Ⅱ and glucose dehydrogenase[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(10): 1647-1655. (in Chinese) 姜佳伟, 张荣珍, 周晓天, 等. (S)-羰基还原酶Ⅱ与葡萄糖脱氢酶共催化高效合成(S)-苯乙二醇[J]. 微生物学报, 2016, 56(10): 1647-1655.
[18]	Weckbecker A, Hummel W. Improved synthesis of chiral alcohols with Escherichia coli cells co-expressing pyridine nucleotide transhydrogenase, NADP+-dependent alcohol dehydrogenase and NAD+-dependent formate dehydrogenase[J]. Biotechnology Letters, 2004, 26(22): 1739-1744. DOI:10.1007/s10529-004-3746-2
[19]	Yun HD, Yang YH, Cho BK, et al. Simultaneous synthesis of enantiomerically pure (R)-1-phenylethanol and (R)-α-methylbenzylamine from racemic α-methylbenzylamine using ω-transaminase/alcohol dehydrogenase/glucose dehydrogenase coupling reaction[J]. Biotechnology Letters, 2003, 25(10): 809-814. DOI:10.1023/A:1023500406897
[20]	Hummel W, Abokitse K, Drauz K, et al. Towards a large-scale asymmetric reduction process with isolated enzymes: expression of an (S)-alcohol dehydrogenase in E. coli and studies on the synthetic potential of this biocatalyst[J]. Advanced Synthesis & Catalysis, 2003, 345(1/2): 153-159.