一、重组蛋白表达系统比较
随着基因工程技术的发展，大量重组蛋白得到了有效地外源表达。目前主要的重组蛋白表达系统有:大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等表达体系 [1]。相比之下(表1)，各种表达系统各有优缺点:
表1 各种表达体系特征比较
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表达体系 |
优缺点 |
产量 |
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原核体系 |
大肠杆菌 |
具有良好的可操作性,成本低,但不能进行糖基化修饰,胞内形成包涵体 |
外源蛋白10%～70%胞内表达,0.3%～4%胞外表达 |
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真核体系 |
酵母 |
兼具原核细胞良好的可操作性和真核系统的后加工能力,但存在产量低及过度糖基化等问题 |
外源蛋白约占菌体总蛋白的10% |
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甲醇营养型酵母 |
第二代酵母表达系统,部分克服了过度糖基化缺点,有较好分泌性,产量较高,但产物结构与天然分子仍有一些差异。 |
外源蛋白占菌体总蛋白的10～30% |
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昆虫细胞 |
具有高等真核生物表达系统的优点,产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似,表达水平较高,但糖基化程度较低,形式单一。 |
外源蛋白占菌体总蛋白的1～500mg/L |
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哺乳动物细胞系统 |
产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质最接近,糖基化等后加工最准确,但表达水平较低。 |
发酵液中表达产物含量为0.2～200mg/L |
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使用大肠杆菌表达系统能够在较短时间内获得表达产物，且所需的成本相对较低；但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低[2]。酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，成本低，但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同。哺乳动物表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态，但表达量低，操作繁琐，而且成本非常昂贵[3]。
由于不同的表达系统在表达量、蛋白表达周期、蛋白折叠和加工能力、蛋白翻译后修饰如糖基化修饰和经济成本等方面存在差异，因此需要根据不同的重组蛋白特点以及不同应用目的来选择合适的表达系统。
二、酵母表达系统
2.1 毕赤酵母表达系统概述
现在已经建立和发展了多种酵母表达菌株，这些酵母各有特点，自1981年Hitzeman等用成功地表达了人干扰素以来，S.c表达了大量的外源蛋白，目前仍在在制药业中广泛应用。但具有一定的局限性，如难于高密度培养，缺乏强有力的启动子，分泌效率低，很难分泌分子量大于30kDa的外源蛋白质，而且富含甘露糖型的超高糖基化，表达蛋白质的C末端经常被截短[3]。人们在研究过程中发现一种更好的表达系统——毕赤酵母表达系统，目前该表达系统被广泛应用，此系统不仅具有高稳定、高表达、高分泌的特点，而且其宿主甲醇酵母一巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)具有高密度生长的特性。甲醇酵母是可利用甲醇作为单一C源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、PichiaPastoris三种。其中P.Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛，己被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越收到人们的重视。
毕赤酵母表达系统已基本成为非常完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子A0X1，已高效表达了多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模。2009年来自该系统的KALBITOR已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的。毕赤酵母表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品。
2.2 毕赤酵母的优势
毕赤酵母系统的成功应用，缘于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点:
(1)含有AOX启动子，这是目前启动能力最强，调控机理最严格的启动子之一，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；
(2)表达量高，既可以胞内表达，又可以分泌表达。绝大多数外源基因比在原核细胞、酿酒酵母、真核细胞中表达量高。一般毕赤酵母中外源基因都带有分泌信号肽，使外源目的蛋白分泌到培养液中，方便纯化；
(3)发酵工艺成熟，适合高密度发酵。己经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达150g/L以上[10]，表达重组蛋白时，已成功放大到80，000升；
(4)使用基础盐培养基。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；
(5)遗传性状稳定。一般外源基因整合到巴斯德毕赤酵母染色体上，随着染色体的复制而复制，不易丢失；而且遗传背景清楚，便于遗传操作。
(6)作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰的功能。
2．3毕赤酵母存在的问题与解决方案
与其他表达系统一样，毕赤酵母也存在一些问题，特别是表达量低和一些失败的例子也在不断出现，通过阅读文献，汇总如下问题以及解决办法：
(1)蛋白酶对产物的降解:毕赤酵母表达系统其最明显的一个缺陷就是分泌表达的蛋白在培养中可以被自身分泌的蛋白酶降解。由于毕赤酵母多采用高密度发酵，蛋白酶也会显著增多，外源蛋白也就易受到蛋白酶的作用而降解[11]。大量的相关研究已用于解决这个问题[13]。
(2)特殊的外源蛋白的不能分泌:在实际应用过程中一些基因并没有表达出可以检测到的目的蛋白，如HIV表面糖蛋白[12]。原因可能是因为酵母自身的转录终止导致mRNA被切断。这一问题在富含AT的破伤风毒素基因被描述，可以通过全基因合成人为增加GC的含量而得以改善[13]。
(3)甲醇的潜在问题:毕赤酵母不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇，而且
大量甲醇的堆放成为潜在风险源。可以通过更换表达启动子或者表达菌的甲醇利用型来解决这个问题[2]。
(4)发酵周期相对较长:发酵虽然能达到非常高的菌体密度，但是发酵周期一般相对原核细胞明显较长，容易被污染，且长时间的发酵也不利于外源蛋白的累积。目前有许多不同的发酵策略可以选用，一定程度上缓解了该问题[2]。
(5)高度甘露糖型糖基化:酵母表达系统的一个突出的缺点就是虽然能对产物进行糖基化，但糖基化的方式是高甘露糖型，与哺乳动物细胞不同[14]。针对这个问题，可以采取突变N-糖基化位点，或者对宿主菌进行糖基化工程改造[4]
三、 毕赤酵母表达系统的载体、菌株和转化机制
在过去的研究和应用中，毕赤酵母表达系统已成为目前应用最为广泛的酵母表达系统，也成为重组蛋白研究和商业化生产的重要表达系统之一。下面将详细讨论外源蛋白在毕赤酵母中表达的影响因素。
3．1 毕赤酵母表达菌株的选择
目前所使用的各种巴斯德毕赤酵母菌株均来自于原始的Y-11430菌，而各菌株的差异主要表现在基因型的差异上，其中包括野生型、营养缺陷和蛋白酶缺陷。
常用的毕赤酵母宿主菌基因型和表型如表2所示，其中GS115，KM71和SMD1168含有HIS4基因突变而不能合成组氨酸，部分表达载体中含有HIS4基因作为筛选标记，转化子可以在组氨酸缺陷型培养基中生长。另外GS115，X33，和SMD系列菌株含有野生型的A0X1基因，高达85%的甲醇利用率是由该基因完成的，转化子通常产生Mut+甲醇利用表型；而KM71和KM71H的A0X1由于基因突变，不能正常的代谢甲醇，甲醇氧化酶A0X2开始负责代谢甲醇，但是这个酶的启动子非常弱，该酶A0X2的表达量较低，甲醇利用速度较慢，转化子通常产生Muts表型。Mut+甲醇利用表型的转化子可以快速代谢甲醇，因此在甲醇培养基中可以快速生长，诱导表达时需要消耗大量甲醇，而Muts表型转化子代谢甲醇能力很弱，诱导表达时需要的甲醇量很少。因此他们各有缺点，尽管多数人倾向于使用Muts菌株，但是有时候Muts菌株也可能获得更髙的表达水平。SMD系列菌株是胞外蛋白水解酶缺陷型菌株，在使用非复合培养基时通常可以降低分泌蛋白产物的降解[2]。
表2常用酵母的基因型和表型
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株系 |
基因型 |
表型 |
应用范围 |
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GS115 |
His4 |
Mut+ |
适用于含有his4的表达载体 |
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X33 |
Wild type |
Mut+ |
适用于Zeocin抗性表达载体 |
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KM71 |
his4, aoxl, arg4 |
Mut+ |
适用于含有his4的表达载体 |
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KM71H |
aoxl, ARG4, arg4 |
Mut+ |
适用于Zeocin抗性表达载体 |
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SMD1165（H） |
His4，pep4 |
Mut+ |
胞外蛋白酶A活性缺失 |
3．2表达载体的选择
目前可用于酵母表达系统的商业化表达载体有十几种[7]。这些载体的主要区别在于:
(1)是否含有信号肽，含有哪种信号肽；
(2)是否含有营养缺陷型的基因，含有哪种营养缺陷型的基因；
(3)是否含有抗性基因，含有哪些抗性基因；
(4)含有哪些启动子；
下面就几种常用的载体介绍一下这些载体中重要元件。可根据毕赤酵母表达图谱进行选择。不同的表达载体在信号肽、营养缺陷型和抗性基因上有所差异，应该根据实际应用进行选择。
3．2．1信号肽
对于一些在多克隆位点之前含有信号肽的载体如PPIC9K，往往用于胞外表达；对于不含信号肽的载体如PA0815，则用于胞内表达，或者用于含外源基因自身信号肽的胞外表达。酵母信号肽中最常用信号肽就是a交配因子前导肽。此外，常用信号肽还有酸性磷酸酶信号肽PHO、invertase信号肽SUC2等。对于有些蛋白，为了避免过度的糖基化修饰，这可采用胞内表达的策略，这时不需要任何信号肽。
3.2.2营养缺陷型
早期Invitrogen推出的商业化载体，含有正常的组氨酸脱氧酶基因(HIS4)，因此常常在转化his4菌株中作为筛选标志。此外，最新推出的PichiaPink表达系统则是ADE2基因缺陷。
3.2.3抗性基因
为了简单快速获得高表达的转化子，往往还要进行目的基因高拷贝克隆的筛选，因此就需要在这些载体上引入抗性基因，如抗G418(kanamycin)的基因，后来就有了PPIC9K表达载体，这样就可以通过提高G418的浓度，来筛选高拷贝的表达克隆。然而，事实并没有那么完美，一些问题随之而来。首先，由于这些载体比较大(9。0kb-9。3kb)，因此体外克隆
Fig. 1 Vector diagrams of pHIL-D2 and pPIC9
（图片来源：Pichiaexpression Kit Version M 011102 25-0043）
相对困难，而且转化宿主菌后遗传稳定性差；其次，并不是所有的应用都需要特定勒点的基因取代，因此载体中3'AOX序列往往不需要；事实上，由于HIS基因本身较大，而且不参与高拷贝筛选，因此往往需要引入新的抗性基因，这样进一步加大载体。后来大量的研究工作用来寻找新的筛选标记，以减小载体并能实现高拷贝筛选，最终发现了Shble基因产物可以耐受zeocin抗生素，进而开发出pPICZ系列的表达载体(图1。2)。这些zeocin抗性的载体只有5'A0X的启动子序列、A0X1转录终止序列以及Shble基因序列。尽管这些载体不能直接进行AOXl的基因取代，但是可以通过对zeocin的超高抗性筛选具有高拷贝表达盒的转化子。如果转化时基因取代发生在A0X1基因上，那么这个基因会被破坏，进而产生甲醇利用慢型(Muf)的克隆。在这些zeocin抗性的载体中，表达盒可被单一位点的及m/n和Bg!U从载体中切下，这样便于进行体外高拷贝的构建，PA0815也可实现这个功能，但是由于PA0815载体较大(7。7kb)'因此克隆较难且转化子遗传学稳定性差。这种多拷贝表达盒还可以用来表达不同的蛋白，特别是多亚基的异源多聚体蛋白[2]。
3．3外源基因转化或整合到基因组
酵母转化是通过将表达盒整合到酵母基因组的特定位点来产生遗传学稳定的转化子。目前毕赤酵母的转化有多种方法:①电穿孔法；②原生质球法；。③PEG法；④锂盐法。锂盐法和PEG法方法简便，但转化效率很低；原生质球法、电穿孔法效率较高。由于原生质球法操作繁琐费时，电穿孔法简便、快速、高效，但是依赖于一定电穿孔设备。由于甲醇酵母表达载体不含有酵母复制原点，所以线形载体DNA可以通过它与宿主基因组的同源序列发生同源重组产生稳定的毕赤酵母转化子，这些转化子在选择压力下会保持相当好的遗传学稳定性。载体中的外源基因用过同源重组插入或取代整合到酵母基因组，整合有如下两种方式[15]:
(1) 外源基因在his位点或AOX1位点插入整合到基因组:
选择在标记基因HIS4或位点处进行单酶切使表达载体线性化后，将其转入适当的营养缺陷型毕赤酵母菌(GS115)内，经过同源重组以单交换(singlecrossover)的方式插入毕赤酵母菌基因组中(如图2)。此种整合的成功率为50%-80%，转化子的Mut表型与原宿主菌相同。发送在在位点的插入可以是以下任意一处:卻启动子序列、转录终止序列(transcriptiontermination，TT)和AOn下游序列C3，A0XD。当选用的宿主菌为KM71时，对应的插入位点则是aoxl::ARG4(ARG4基因取代原有位置的107)。在转化时，单位点的多拷贝插入以很低的频率(1%-10%的His+转化子)随机发生，因此使用梯度抗性平板进行进一步筛选非常必要。
Fig. 2 Gene insertion events at his4 in single crossover manner
（图片来源：Pichiaexpression Kit Version M 011102 25-0043）
(2)外源基因在AOXl位点发生取代(双交换)整合到基因组:
载体经酶切后，使其外源基因表达元件和标记基因的两端与酵母染色体Aon基因启动子和3'端发生双交换(doublecrossover)取代整合，整合率为10%。但无论是采用单交换还是双交换，得到的His转化子其中一部分是假阳性，这是因为当载体的HIS4位点和宿主基因组his4位点发生同源重组时，不带有任何其他载体的野生型His4基因也可以同样发生重组，此种概率约占His+菌落的10%-50%，采用电激转化法时发生频率最高，以只通过在不含组氨酸的培养基筛选是远远不够的，还要运用抗性平板进行复筛。
那为什么要对载体进行线性化了?在转化时，线性化的位点往往决定着转化子的表型，酵母转化时发生同源重组，需要在目的基因的两端连有同源臂(同源臂的长度无具体要求，几十到几百个碱基)。环形的载体在特定位点切开后，整个表达盒前后两端分别具有酵母的同源序列，从而发生交换重组。事实上，在转化时即使不对载体进行酶切线性化，也能非特异整合到酵母基因组，只是重组的效率很低，而线性化则是大大提高了在特定位置的同源重
Fig. 3 Gene insertion events at his4 in single crossover manner
（图片来源：Pichiaexpression Kit Version M 011102 25-0043）
组效率。进一步的说，只要在表达盒两端连有同源臂，并且整个表达盒含有筛选标记，则可以进行同源重组整合到酵母基因组，而并非一定需要使用上述的表达载体，如利用酵母rDNA非编码区进行同源重组[16]。
四、影响外源蛋白在毕赤酵母中表达水平的主要因素
目前己有许多外源基因在毕赤酵母中成功表达，但也有许多蛋白的表达量并不理想。尽管表达蛋白的产量在很大程度上受其自身遗传特性的影响，但是，充分利用某些影响基因表达和产物稳定性的因素，能够显著增加外源基因的表达量。以下就这些因素做一点总结:
4．1表达启动子的选择
毕赤酵母表达最常用的启动子为乙醇氧化酶AOX1、AOX2的启动子。AOX1与氧气的亲和力较弱，因此毕赤酵母需要上调这个酶的启动子以大量表达AOX1来增强利用氧气氧化甲醇的能力。事实上，当以甲醇为单一碳源时，AOX1可以占到30%的菌体总蛋白。如此强的表达启动子理所当然可以驱动外源重组蛋白在毕赤酵母中的高表达，即使这个外源基因在酵母基因组中只有一个拷贝。另外，AOX1启动子是一种精细调控的启动子，非限制性碳源如甘油、鹿糖会在转录水平抑制这个启动子的活性减少在菌体扩增过程中出现不表达突变体的可能性。这个特点也非常有利于毒性蛋白的表达[19]。
如果在发酵时选择Mut+型的表达菌，那么在整个诱导表达的过程中要消耗大量的甲醇。由于甲醇是一种易燃易爆品，因此在大规格发酵过程中，大量的甲醇成为了一种不可忽视的安全隐患。Muts型的表达菌依赖唯一的基因产生较低量的AOX酶的启动子较弱来代谢甲醇，因此Muts型的表达菌耐受甲醇的浓度较低，从而在菌体生在阶段不能仅仅依赖甲醇。为了克服这个限制，在菌体生在阶段可以选择一些替代性的碳源，如山梨醇、甘露醇、海藻糖或者丙氨酸。这些碳源在整个发酵过程中既可以维持很好菌体生在，又不会抑制AOX酶的诱导表达[22]。例如，研究人员利用一种A0X1和都缺陷的Mut_型的毕赤酵母MC100-3在A0X1的启动子的作用下进行蛋白表达，菌体在非JftTi启动子抑制型碳源(如山梨醇、甘露醇)的培养基中进行扩增，然后加入少量的甲醇就可以诱导启动子驱动目的蛋白的表达[24]。
另外，毕赤酵母三磷酸甘油酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)的启动子P(3AP也是一种常用的酵母表达启动子。PGAP是一种组成型启动子，使用PGAP在发酵时不需要甲醇诱导，不需更换碳源，工艺简单，而且产量很髙，所以成为替代Paoxi的强有力的启动子。在P。AP启动子的驱动下，比较不同碳源如葡萄糖、甘油、甲醇、油酸等对蛋白表达量的影响，发现以鹿糖最为碳源蛋白表达量最高[15]。Doring等分别用pGAPZB和pPICZB来表达兔肾肽载运蛋白和人小肠肽转运蛋白，前者表达的这两种蛋白，前者表达的这两种蛋白的产量均比后者高4倍[16]。另外，还有一些启动子用于毕赤酵母蛋白表达，如来源于GTPase基因的YPT1启动子，这是一种组成型启动子；又如依赖谷胱甘肽的甲醛脱氧酶启动子PFLD1和二轻基丙酮合成酶(dihydroxyacetoneSynthase，DHAS)启动子，是以甲醇或甲胺为单一碳源的诱导型启动子，也是髙水平表达的启动子。但是不同于PA0X1的是，葡萄糖饥饿可诱导AOX启动子驱动外源蛋白表达，而对DHAS启动子没有任何影响[27]。
4．2外源基因拷贝数的影响
许多表达实例都证实，单个拷贝的表达盒就足已达到最佳的生产水平[8]，特异地增加拷贝数会对表达无明显效果。然而在实际应用时我们常常需要筛选高拷贝克隆，一方面因为多拷贝数转化子(>10)更容易获得令人满意的高效表达[21]；另一个方面因为如果转化子的某个拷贝发生了突变，那么由于其是高拷贝，最终对于表达产物的影响较小[20]。
在转化时，多拷贝整合的几率大约是1%-10%，但是关于外源基因拷贝数与蛋白表达水平之间的对应关系经常不一致。不少研究证明，增加外源基因的拷贝数可以显著提高蛋白表达水平，比如从HBsAg[31]、破伤风毒素蛋白C片段[18]、和白细胞介素-10[22]的表达上看出。也有一些外源蛋白即使单拷贝也能得到较高的蛋白产量，提高拷贝数对表达水平没有明显影响。甚至有些外源蛋白在一定的拷贝数范围内表达量较高，提高拷贝数甚至对蛋白表达水平有不利的影响[33]。
增加转化子拷贝数的方法很多。通常来说，化学转化法就比电转化法使毕赤细胞产生多拷贝转化子的频率要高。但是电转化法配合G418或者Zeocin抗生素筛选高拷贝往往更简单易行。而且转化子抵抗抗生素的能力与整合基因拷贝数成正比。另外，还有其它增加拷贝数的方法:用DNA连环或专门构建的多拷贝载体如PA0815，在体外构建好多拷贝表达载体后再转化毕赤巴斯德酵母；还有通过梯度增加zeocin浓度逐步筛选，通过转化后载体扩增的方式提高拷贝数[8]。
Invitrogen推出了 Pichia pink系列的酵母表达系统，提供了一种利用营养缺陷型筛选高拷贝的转化子的方法，应用上简单方便。在一些很少的实例中，增加拷贝数对蛋白质的表达产量反而会有副作用。髙拷贝数不能高表达的可能原因是外源mRNA的翻译效率或蛋白通过内质网中不能正确折叠或者折叠效率低下造成的；而对于一些分泌效率低的蛋白，过高的表达会对分泌途径产生负反馈抑制。
4．3外源基因的特性和密码子偏好性
4．3．1外源基因的结构
外源基因在毕赤酵母中重组表达时，其自身序列就是影响表达水平的一个重要因素。不同的培养基选择、发酵参数设置和培养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非提高单个细胞表达量来提高总体外源蛋白的产量[28]。信使mRNA5'和3'-UTR(非翻译区)碱基序列过长不利于蛋白质的最优化生产。高效表达的启动子的的mRNA的前导肽长度为114nt，AT含量高的基因常会由于提前终止而不能有效转录。提前终止是一种具有种属特异性的现象，譬如在巴斯德毕赤酵母中不能表达的HIV表面糖蛋白，在酿酒酵母中却表达良好。因此，可以通过调整AT含量区的碱基组成，使AT含量保持在30%-55%之间，避免提前终止的发生。利用这个思路，人们构建了各种重组酵母菌，高效地表达了破伤风毒素片段C。在毕赤酵母中己证实，当HIV表面糖蛋白中阻止转录的序列5'ATTATTTTATAAA3'变成5'TTTCTTCTACAAG3`后，提前终止现象不再出现[16]。
4．3．2密码子偏好与优化
随着毕赤酵母表达系统的广泛应用，其密码子优化的研究也逐渐深入。不同的课题组根据不同的算法计算出了毕赤酵母密码子的偏好性，并且给出了毕赤酵母偏好密码子和稀有密码子统计表，以作为异源蛋白在毕赤酵母中进行密码子改造的指导。通过这些算法获得的毕赤酵母偏好密码子的结果基本一致。此外，毕赤酵母的偏好密码子与酸酒酵母偏好密码子相比也存在少量差异，例如Gin在毕赤酵母中偏好密码子是CAG，而在酿酒酵母中是CAA；Glu在毕赤酵母中是GAG，而在酿酒酵母中却使用GAA[37-40]。
另外，因为不同物种的外源基因的偏好密码子的差异特别大，所以往往导致目的基因中存在许多的毕赤酵母的稀有密码子，进而影响了mRNA的翻译效率与蛋白表达水平。许多实例证实使用毕赤酵母的偏好密码子，对目的基因编码区进行全序列优化，通常可以提高数倍到数十倍的表达水平。因此，合成基因时，在坚持氨基酸不变原则的前提下，可设计利用毕赤酵母偏爱密码子，以获得外源蛋白高效表达的菌株。有时甚至只对基因编码区5'末端进行密码子优化，或者仅仅去除基因中一些个别的稀有密码子，就能对蛋白表达产生很大的影响。伴随着密码子优化的一个副产品就是基因中GC含量的改变，其可以影响mRNA的二级结构和稳定性而影响蛋白表达水平，这种作用甚至与是否使用偏好密码子无明显关系[21]。因此，在釆用毕赤偏好密码子优化外源基因时通常需要综合考虑以下问题:
(1) 利用毕赤酵母的偏好密码子，以提高mRNA的整体翻译效率；
(2) 调整外源基因AT的含量，以免导致转录提前终止；
(3) 提高翻译终止效率，往往TAA和TGA下游紧邻的碱基G/A比C/T更能有效终止翻译；
(4) 去除基因序列中影响信使RNA翻译和稳定性的二级结构，特别是信使RNA的转录起始区域和5'-UTR附近避免形成发卡结构；
(5) 去除导致信使RNA不稳定的序列和结构，相对稳定的信使RNA有利于提高整体翻译效率。
4．4表达条件
在摇瓶条件下影响毕赤酵母外源蛋白表达的主要因素有培养基成分和pH值、诱导表达的温度和时间、菌体生长状态等。
4．4．1 pH
尽管在pH3。0-7。0之间毕赤酵母都可以较好的生长，但是不同的外源蛋白对胞外蛋白酶和pH的敏感性不同，因此可以优化pH值来增加蛋白的稳定性以提高表达量。研究发现鼠的表皮生长因子和人血清白蛋白在pH6。0时产量最高[9]，但是细胞因子生长抑制肽却在pH3。0时产量最高[23]。
4．4．2温度
研究发现降低诱导表达的温度可以提高蛋白表达水平，并减低培养液中蛋白酶的活性，一般认为低温有利于蛋白的正确折叠并且降低蛋白酶的降解作用[14]。
4．4．3有害成分
培养环境中一些过量或不适当的成分，以及表达的外源蛋白都有可能对宿主毕赤酵母产生毒性作用从而影响表达，例如过量甲醇在培养基中对酵母有毒害作用，使其表达更多的自身菌体蛋白，甚至会导致酵母大量死亡[17]。
4．4．4蛋白酶
外源蛋白经常因为毕赤酵母自身分泌的蛋白水解酶，或者蛋白本身不稳定而使产物降解，可以利用以下策略减少蛋白降解:使用蛋白酶缺陷型酵母菌株；使用丰富培养基，加入酪蛋白水解产物等，以提供给过量的底物而减少外源蛋白的降解；加入一些蛋白酶抑制剂等[48]。
4．5产物稳定性
酵母细胞中有一种Kex2蛋白水解酶，能专一性水解a-factor信号肽前体中梭基端肽键，即连续的两个碱性氨基酸(如LySArg，LysLys，ArgArg，LysArg)，酵母表达的外源蛋白发生降解的原因往往就在于此。通过改变培养基的pH值、加入适量的酵母提取物和蛋白胨或酪蛋白水解产物，也许能够提高外源蛋白的稳定性，而某些酶抑制剂如m)TA，虽然也能增加其稳定性，但却常会使一些原先并不明显的蛋白变得非常明显，影响其使用效果。有时候降低培养的问题，也能有效增强目的蛋白的稳定性。另外，改造巴斯德毕赤酵母表达宿主菌株，缺失基因组中主要蛋白水解酶基因，使目的基因稳定。例如，使用蛋白酶缺陷菌株如SMD系列菌株亦可避免产物降解发生[7]。
五、毕赤酵母的发酵控制与优化
目前毕赤酵母广泛用于外源蛋白的表达，虽然诸如菌株表型、启动子的选择、培养基以及培养条件等可以优化表达，但是在工业生产上，不仅仅需要获得高产量，也注重发酵批次之间的可重复性。因此需要稳健和自动化的条件下进行发酵控制。这些发酵控制的策略包括:培养基的组成、发酵参数监控、发酵动力学、甲醇流加方式等[19]。
5．1发酵培养基和生长条件
大量实验证实，最优的发酵条件(培养基、温度、pH等)往往因发酵菌株和外源蛋白而有所不同，因此没有一个固定发酵方案，但却有一些发酵优化的指导原则值得我们认真学习。
目前使用最广泛的高密度发酵培养基是Invitrogen公司推出的基础盐培养基(BSM)，这是一个标准的发酵培养基，然而却不是最优的，仍然存在一定的问题，如不平衡的组份、沉淀、离子强度等[49]。BSM—般来说提供了高浓度的基础元素，几乎都在Wegner提供的参考浓度的上限。与此相反，d'Anjou培养基的化学元素均在Wegner提供的参考浓度的上限附件[11]。很多研究人员研究主要盐分对于酵母菌体生长的影响，并确定了每项盐分的最优范围，因此一些优化的培养基如FM22之类的应运而生。这些培养基在和钾的浓度上面有这明显的不同。另一个显著不同就是这些培养基的氮源，BSM和FM22的氮源主要来自调控pH的氨水，而D'Anjou则在配置的时候就已经添加到培养基中，在发酵过程无需继续添加。有研究称氮源的缺乏会导致水解蛋白酶的增加，则会降解目的蛋白。因此在发酵过程中往往根据需要实时监控，以补充氮源。同时也要避免氮源的累积，否则会抑制菌体生长，延长对数期。
所有这些基础盐培养基培养基都需要添加一些铁、铜、猛、生物素等微量元素，目前使用最多的是Invitrogen公司推出的PTM1微量元素溶液。关于这方面的研究也比较少，Boze和他的研究团队发现在BSM中添加7种维生素和2种微量元素相对于BSM+PTM1可以促进酵母的表达[12]。
在高密度发酵时，由于高速搅拌和通气很容易在发酵罐中产生大量泡沬，而一般的机械方式难以有效减少泡沫，因此“泡敌”的添加在发酵时非常必要。桂酮基类的泡敌抗泡效果非常好，但是对菌体的生长速率和氧气交换效率有一些影响[13]。毕赤酵母的最适生长温度是3()℃，高于32℃时蛋白表达停止，菌体生长迅速衰退。但是大量研究表明，对于某些蛋白选择较低温度可以显著增加蛋白的表达量或表达形式。比如Hao及其团队报道降低温度到20度可以显著的增加表达上清中cIFN单体，降低多聚体[4]。Jahic等报道，降低温度可以降低发酵过程中水解蛋白酶的活性和菌体的裂解[5]。
毕赤酵母可以生长在一个较宽的pH范围内(pH3-7)，最常用的pH范围为5-6。特别是一些对于水解蛋白酶敏感的蛋白，降低pH可以显著抑制中性蛋白酶的活性，增加蛋白稳定性。但是需要注意的是很多外源蛋白本身对于pH比较敏感，而且降低pH可以增加酸性蛋白的活性，因此往往需要做一个pH梯度优化，来确定适合特定外源蛋白的最适表达pH。对于BSM而言，当pH>5时，就会产生沉淀，干扰0D600的检测，而且容易造成营养元素的缺乏[9]。
毕赤酵母的发酵周期视菌株和培养方式而有所不同，通常来说，补料分批培养(fed-batch)比batch发酵周期要长。对于一个确定的菌株，使用确定的培养方式，发酵周期一般可以确定。因此，发酵周期需要通过具体实验来确定。
5．2发酵的主要阶段
补料分批培养主要分三个步骤:甘油培养阶段(glycerolbatchphase，GBP)、转换阶段(transitionphase，TP)和甲醇诱导阶段(methanolinductionphase，MIP)。下面简单介绍一下这几个步骤[49]。
5．2．1甘油培养阶段
甘油培养阶段的主要目的就是在诱导表达之前以最短的时间获得足够多的菌体(biomass)。野生型毕赤酵母以甘油为碳源的最大生在速率是0。181/h，高于以甲醇为碳源的生在速率(0。141/h)。事实上，表达菌由于受外源蛋白的影响，在以甲醇为碳源的生在速率还要再低一些。本阶段的菌体生长于毕赤酵母的表型无关。一般来说，本阶段甘油的浓度是40g/L，如果高于这个值，生长反而受到抑制。Brierley及其研究团队推荐最大甘油浓度为6%，而Chimvolu及其研究团队发现当甘油浓度高于7%，发酵液中乙醇浓度则将高达0.5%-2.4%[16]。
检测发现，收获的生物量(菌体干重)与底物(甘油)的比率大约是0.5，因此在本阶段结束之后，最终的生物量大约是20g/L。当甘油耗尽时，融氧(dissolvedoxygen，DO)曲线会迅速上漂，这个时候就是提示我们该补料了。
5.2.2转换阶段
转化阶段的目的有两个，一是继续提高生物量到达高密度培养阶段，而是A0X1启动子的去抑制(在诱导阶段需要去除过量的甲醇)。一些研究人员选择恒定甘油流速的补给方式，另一些研究人员选择指数流加的甘油补给方式以实现菌体的限制性生在[17]。甘油消耗的最大速率是0.0688g/(gh)，本阶段最终生物量因人而异，但是一般大于30g/L。在补料阶段，在甘油补给的同时，逐渐的添加一些甲醇，有利于A0X1启动子的去抑制化。通过这种混合补料方式，可以提前进行甲醇诱导，缩短本阶段的时间。而且，补充的甘油可以较好的支持菌体合成醇氧化酶。在本阶段不同的甲醇流加方式均有所报道:一，根据DO的响应增加甲醇流速至7.6mL/(hL)；二，维持恒定的甲醇浓度，如4g/L或1-2g/L；三，甲醇诱导之前碳源饥饿1个小时以确定所有的甘油消耗殆尽；四，程序降低甘油流速同时维持一个恒定的甲醇流速。FranciscoValero等认为，在限制型生长的条件下，程序设定的甘油流加同时维持一个低于4g/L的甲醇流速可能是最优的流加方式之一，且与毕赤酵母表型无关[19]。
5.2.3甲醇诱导阶段
诱导外源蛋白最大化表达的最重要的因素之一就是甲醇诱导阶段的甲醇补给策略，同时也限定了本阶段的生长速率[17]。而且，甲醇诱导阶段与生长条件、菌体表型、外源蛋白特性均息息相关。蛋白的合成、加工、分泌均能影响菌体的生长。大量关于发酵的研究都是关于优化甲醇诱导阶段的甲醇补给策略，其中一些甲醇补给策略介绍如下
(1)DO响应控制
在这种控制方式中，甲醇的流加速度与DO监控曲线相关，当DO曲线上漂时，甲醇流速增加。有多篇报道认为，相对于手动控制甲醇流速，DO响应控制可以有效提高生物量和蛋白表达量。然而也有一些报道认为，为了增加发酵过程的稳定性，使用了DO响应控制既不能实现甲醇浓度也不能实现特异性生长速率的批次稳定性。这些事实让研究影响异源蛋白表达的多种因素变的更加困难。DO响应控制还有另一个问题，就是当甲醇浓度达到抑制菌体生长时，DO曲线会上漂，这时甲醇流速会加大，甲醇浓度进一步提高，更加严重地抑制菌体生长[19]。
(2)甲醇流加开环控制模式
流加速度根据菌体的生物量以一种具有特异性生长速率的理论方程的形式增加而增加。这种流加方式基于一种简单无在线信息的生长模型。为了实现这个模型，假设在诱导一开始的时候生物量的浓度和体积就是已知的。在这种甲醇流加模式下，张和他的研究组根据经验开发出甲醇指数流加方式[7]。Trinh和他的研究组评估了恒定甲醇浓度、DO响应控制和指数流加方式等三种甲醇控制策略，虽然最终的总蛋白得率基本一致，但是指数流加方式的甲醇消耗和生物总量最低，因此其相对特性性产物表达量就最高[9]。上述两种甲醇流加控制方式中，甲醇浓度既不是在线监控又不是直接控制，因此发酵批次间的甲醇浓度、甚至不同阶段的消耗、累计均显著不同。甲醇控制在诱导阶段影响菌体的生长和蛋白的表达，因此如果想获得稳健的、可重复的发酵工艺，甲醇浓度的精确监控和控制非常需要。最简单的闭环控制策略就是“开、关”的控制模式，虽然有一些研究人员声称获得了满意的结果。但是，需要注意的，这仅仅是表面现象，生物过程特别是异源蛋白表达是高度非线性的动力学过程，简单的“开、关”的控制模式远远不足以实现生物反应器中甲醇的精确调控[9]。最优的发酵控制方式和操作条件的问题必须在体积生产力之外被解决。发酵液。中产物蛋白的浓度和其他蛋白的浓度在下游处理中发挥着重要的作用。整个处理过程需要在总成本的基础上进行考虑，比如整个过程中氧气的提供、冷却、原料等[20]。
