一、信号肽的2步切割
pPIC9K载体带有自身信号肽，在分泌过程中被切除，但是由于切割效率，在目的产物N端带有3－5个左右的信号肽的氨基酸。
设计引物时，为了防止切割不完全，能去掉GluAla两个重复单位，不过文献报道多个Glu会提高kex2的切割效率。
要求目的蛋白中不能含有信号肽酶切割序列：glu-lys-arg-glu-ala-glu-ala。
信号肽的切除分为两步：kex2在glu-lys-arg和glu-ala-glu-ala之间初步切除，STE123在两个glu-ala之间切割。
二、是否在3' 端是带上一些其本来的序列？
1,首先，你要保证表达后细胞内信号肽酶能正确识别原来的位点，即此位点是不能随便增减的，否则信号肽不能正常切割，在这个基础上你再决定3' 端其本来序列的去留。
2，一般5'端多出一些氨基酸不会明显影响到你的目的蛋白的活性，我们平时在做酵母表达时，信号肽切割后，目的蛋白往往有几个多余的AA，这对活性好象没什么影响，虽然如此，但你还得注意多余AA的性质，不能过酸或过碱。
三、重组pPIC9K/GS115表达出目的条带后，
确定信号肽是否切除完全的方法：
1、N端测序
2、先查查你的氨基酸序列里有没有糖基化位点，如果有就只能N端测序了。如果没有，看分子量大小。
信号肽中有kex2和ste13两个酶切位点，现在担心的是kex2的位点酶切完全了，但ste13的两个酶切位点glu， ala重复序列没有切干净，如果这两个氨基酸没有切除完全的话，分子量差异不大，两个氨基酸的差异应该看不出来，一般来说，N端多一两个AA应该对蛋白的活性没有太大影响。western检测有两个条带的问题，可能是目的蛋白有一部分被降解了。
四、附：信号肽切割原理和优化切割
《expression of Your Recombinant Protein with a Native N-terminus》
If you wish to have your protein expressed with a native N-terminus, you should clone
your gene flush(直接地) with the Kex2 cleavage site. Use PCR to rebuild the sequence from the Xho I site at bp 1184-1189 to the arginine codon at nucleotides 1193-1195. Remember to include the first amino acid of your protein, if necessary, for correct fusion to the Kex2 cleavage site.
Signal Sequence Processing
The processing of the α-factor signal sequence in pPICZα occurs in two steps:
1. The preliminary cleavage of the signal sequence by the KEX2 gene product,
final Kex2 cleavage occurring between arginine and glutamine in the sequence
Lys-Arg * Glu-Ala-Glu-Ala, where * is the site of cleavage.
2. The Glu-Ala repeats are further cleaved by the STE13 gene product.
Optimization of Signal Cleavage
In Saccharomyces cerevisiae, it has been noted that the Glu-Ala repeats are not necessary
for cleavage by Kex2, but cleavage after Glu-Lys-Arg may be more efficient when
followed by Glu-Ala repeats. A number of amino acids are tolerated at site X instead of
Glu in the sequence Glu-Lys-Arg-X. These amino acids include the aromatic amino acids,
small amino acids, and histidine. Proline, however, will inhibit Kex2 cleavage. For more
information on Kex2 cleavage, please see (Brake et al., 1984).
There are some cases where Ste13 cleavage of Glu-Ala repeats is not efficient, and Glu-
Ala repeats are left on the N-terminus of the expressed protein of interest. This is
generally dependent on the protein of interest.
continued on next page
五、翻译Genebank所查序列
为设计一个引物，在Genebank上查找序列如下：
CDS 序列是 57～560， sig_peptide 从 57～119， mat_peptide 从 120～557。
问题如下：
1、sig_peptide和 mat_peptide 各代表什么意思，sig_peptide是不是就是信号肽，哪mat_peptide 是什么？
2、sig_peptide前面1～57是序列的什么部分？
3、cDNA序列中除了CDS是编码区外其它部分主要起什么作用，在设计引物时应该从第一个碱基开始还是从信号肽开始，还是从CDS的第一个碱基开始！
答：sig_peptide 信号肽，mat_peptide 成熟肽，就是切除信号肽以后的成熟蛋白元件。sig_peptide前面1～57是5‘非编码序列，它一般含有Kozard序列，在翻译起始过程中发挥作用。3’非编码序列是帮助翻译的终止。
母转化原理：
Like Saccharomyces cerevisiae, linear DNA can generate stable transformants of Pichia
pastoris via homologous recombination between the transforming DNA and regions of
homology within the genome (Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1989). Such integrants
show extreme stability in the absence of selective pressure even when present as multiple copies. Note that single crossover events (insertions) are much more likely to happen than double crossover events (replacements). Multiple insertion events occur spontaneously at about 1-10% of the single insertion events.
像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichia pastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子(Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1989).这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件(插入)比双交换事件(置换)发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.
电转化注意点：
一、
1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！
2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。
另附：酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
四、电转化注意点：
1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）
3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。
3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
5个电转化方案
方法一：高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液，室温下放置20min。
处理液：
10mM LiAc
10mM DTT
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，
4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）
5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入 电击杯中，冰浴5min.
6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.
步骤如下：
1、目的DNA（pPIC9K)，经电泳检测已经线性化（SalI酶切）；
2、DNA纯化方法是经酚仿－氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；
3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。
4、将sorbital、水和菌液均冰浴；
5、菌液离心5min－100ml冰水洗涤－50ml冰水洗涤－4ml sorbital洗涤，然后溶解于300ul冰sorbital；
6、加入约5～10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；
7、电击，1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。
9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。
做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：
1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！
2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50ml YPD中，培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。[测OD，用什么作空白对照呢？菌体稀释液，我一般使用PBS]
3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。
2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）
4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。
方法三：简便独特
在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别(成功做出几个基因):
每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。
方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）
1.挑取酵母单菌落，接种至含有50ml YPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.3
2.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2ml sorbital洗涤，然后溶解于200ul冰sorbital；两管分装，每管100ul
3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；
4.电击，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于转化细菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。
将菌体悬液涂布于MD平板上，每300µl涂布一块平板；
方法五: 和Invitrogen公司说明书差不多的方法
X33菌株于100ml YPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率
(1) 1500－1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清
(2) 加入100ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟
(3) 离心，弃上清，再加100ml ddH2O洗一遍
(4) 离心，弃上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
(5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀
加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。
(7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀
静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高
(9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板
(10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。
方法六:酵母感受态细胞的制备
⑴ 接种Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液体培养基，30℃，250~300250 rpm ，过夜。
⑵ 取200µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，一般12小时左右。
⑶ 将细胞培养物于4℃，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑷ 按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
⑸ 按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
⑹ 按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml；
⑺ NOTE：可将其分装为200µl一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。
酵母PCR的6种基因组提取方法
1、简易微波炉加热/-20℃冷冻法提取基因组
在微波炉中档加热1min，-20℃2min，(如果你怕之前效果不够，加热骤冷这两步可以重复一次)加入20ul水，振荡1min，离心30s，上清作为PCR模板。
附：
1.挑选克隆培养过夜；
2.取1ml（或500ul）离心，收集菌体，蒸馏水洗一次，1ml山梨醇洗一次，（轻轻吹打），离心，收集菌体；
3.溶于100ul蒸馏水，80’C/10min,可在PCR仪中完成；
4.离心，收集上清
5.PCR，引物可以用5’AOX, 3’AOX引物
或这个方案：
1.取1ml菌液2500rpm离心5min，弃上清
2.用500ulPBS悬浮沉淀，2500rpm离心3min，弃上清
3.100ulTE融解沉淀，沸水浴10min，－70‘C冷冻40min，1500rpm离心，
4.再次沸水浴10min，1500rpm离心，
5.取上清为模板，以5’AOX1和3‘AOX1引物进行反应
2、手册的溶壁酶法： “毕赤酵母基因组的提取”方法完整的步骤
⑴ 接种重组和空质粒转化子于5ml YPDZ培养基， GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。
⑵ 室温下，1500 g离心5-10min收集菌体
⑶ 100 ulTE（pH 7.0）重悬，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3 ulβ-巯基乙醇，1ul Lyticase ，37℃水浴30 min。
⑷ 10000g离心5~10min，取沉淀，加90ul TE重悬。
⑸加入1 ul 100x proteinK ，10ul 10xSDS，56℃作用30min。
⑹ 200ul 饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s ，取上层水相。
⑺ 加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min；
⑻ 10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；
⑼ 干燥后，加入15 µl的TE或H2O溶解，-20℃备用。
手册中酵母基因组的提取的方法，称之为“溶壁酶法”，还有其他的一些方法，例如“酸性玻璃珠法”，还有一些试剂盒的提取等途径，等等。
“溶壁酶法”法的主要原理是在EDTA存在的情况下，用proteinK（蛋白酶K）消化真核细胞，用SDS溶解细胞膜并使蛋白质变性。核酸通过有机溶剂（如氯仿，饱和酚等）抽提进行纯化。这种方法可以产生十微克至数百微克的DNA。{利用Lyticase（sigma公司）打破细胞，释放重组质粒，需要通过离心收集质粒，以备下一步利用蛋白酶K和SDS作用于质粒，提取整合有外源基因的DNA。}
3、参考“精编分子生物学”上的方法，省去玻璃珠这一步，PCR扩出目的基因，效果还不错。
（1） YPD 培养基的配制：15gYPD粉末,来自Clontech公司,溶于300ml水中，6分钟121℃高压灭菌后，加入4.5 ml Adenine 溶液（Adenine，Sigma,200ug溶于10ml 0.5M HCl中 ）。
（2） 取YPD培养液3ml 到15ml 离心管中，挑AH109 酵母单克隆到培养液中，30℃，200RPM，4小时培养。
（3） 用10ml YPD培养液培养次级AH109，过夜。
（4） 3000RPM，10分钟离心。用0.5ml水重悬。移液于新的1.5ml EP 管中，在室温下离心，倒掉上清，快速振荡。
（5） 取少量酵母菌沉淀，加1 ml消化缓冲液（见《精编分子生物学》,包括：100mmol/L,NaCl; 10mmol/L, Tris.HCl; 25mmol/L EDTA; 0.5% W/V,SDS ）及蛋白酶K（20 mg/ml）,使终浓度达到0.1 mg/ml，65℃水浴使充分消化。
（6） 取出200ul, 加200ul酚/氯仿（1：1）高速震荡3分钟。加TE 200ul, 高速震荡，高速离心13000RPM，5分钟。
（7） 加1/2体积 7.5mol/L (NH3)Ac 及两倍体积无水乙醇,颠倒混匀,室温下13000RPM,3分钟离心。冰70%乙醇洗涤。
（8） 去上清,干燥沉淀, 30ul 无菌水溶解。测OD，-20℃保存。
4、参考细菌总DNA提取方法，简化摸索得到，提取酿酒酵母和毕赤酵母完全可行。产物足以用来做N多次PCR模板。如果使用试剂盒提取的话会非常的纯。
（1）、菌体培养：出发菌先培养18-36小时，获得足够的菌体。
菌体收集：取1.5ml培养液于1.5ml离心管中，12000rpm离心20秒，弃上清，收集菌体（注意吸干多余的水分）。
（2）、消化：每管加入200mg/ml的蜗牛酶50μl，RNase 5μl，处理30-60min。
（3）、裂解：向每管加入200μl裂解缓冲液（40mMTris-乙酸，pH 8.0 20mM乙酸钠，1mM EDTA,1%SDS，其实就是加了SDS的TAE（50倍TAE母液和SDS母液）,用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。
（4）、沉淀蛋白：向每管加入66μl5M NaCl，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，除去蛋白质复合物及细胞壁等残查。
（5）、得到上清液后
A:
将上清转移到新离心管中，加入等体积的氯仿，充分混匀后，12000rpm离心3分钟，进一步沉淀蛋白质。
沉淀DNA：小心取出上清用两倍的无水乙醇沉淀，离心弃上清。
洗涤DNA：用400μl 70%的乙醇洗涤两次。
室温或真空干燥后，50μlTE或超纯水溶解DNA，-20℃冰箱放置备用。
B:
使用DNA快速纯化试剂盒（其实胶回收试剂盒、PCR产物回收试剂盒都可以灵活使用）
5、军科院的方法：
（1）、用酵母细胞裂解液重悬酵母菌
（2）、加酚－氯仿
（3）、加玻璃珠
（4）、振荡半小时
（5）、乙醇沉淀
（6）、电转大肠杆菌
Detailed:
Plasmid Isolation from Yeast
Reagents and Materials Required
The YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (#K1611-1) provides the SDS and lyticase solutions, CHROMA SPIN-
1000 DEPC-H2O Columns, and 2-ml centrifuge tubes for use with the columns.
• Appropriate SD liquid or agar medium to keep selection on the plasmids (Appendix C.A;
Appendix E).
• Sterile, 1.5-ml microcentrifuge tubes (or a 96-tube microtiter array, multichannel pipettors, and
centrifuge adaptor for multiwell plates).
• 20% SDS
• Lyticase Solution (5 units/ml in TE buffer; store at 4°C for up to 2 months or at –20°C for up to
6 months. If colloidal material precipitates, mix the solution by inversion before using.)
• Recommended: CHROMA SPIN-1000 DEPC-H2O Columns (#K1334-1) and 2-ml centrifuge
tubes for use with the columns
• If you do not use CHROMA SPIN Columns, you will need materials to perform phenol:chloroform
extraction and ethanol precipitation:
• Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1; See Sambrook et al., 1989, for information on
preparing neutralized phenol solutions)
• 10 M ammonium acetate
• 95–100% ethanol
1.Prepare yeast cultures for lysis (Step a, b, or c below).
a. From a solid patch of growth:
i. Spread a thin film of yeast cells (~2-cm2 patch) onto the appropriate SD agar medium.
ii. Incubate plate at 30°C for 3–4 days. (The patch should show abundant yeast growth.)
iii. Scrape up a portion of the patch (~10 mm2) and resuspend the cells in 50 ml of sterile
H2O or TE in a 1.5-ml microcentrifuge tube.
b. From a liquid culture:
i. Inoculate a large (2–4-mm), fresh (2–4-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the
appropriate SD liquid medium. Vortex tube vigorously to completely break up the colony
and resuspend the cells.
ii. Incubate at 30°C overnight with shaking at 230–250 rpm.
iii. Spin down the cells by centrifuging at 14,000 rpm for 5 min.
iv. Carefully pour off the supernatant and resuspend pellets in the residual liquid (total
volume ~50 ml).
c. For semi-automated handling of a large number of samples:
i. Place a large (2–4-mm), fresh (2–4-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the appropriate
SD liquid medium in separate wells of a 96-tube microtiter array. Vortex each tube
vigorously to resuspend the cells. (Alternatively, use 0.5 ml of an overnight SD liquid
culture instead of a yeast colony.)
ii. Using a centrifuge adapted for multiwell plates, centrifuge the entire array at 1,000 x g
for 5 min to pellet the cells.
iii. Carefully pour (or draw) off supernatants and resuspend pellets in the residual medium
(~50 ml) by vortexing or pipetting up and down.
2. Add 10 ml of lyticase solution to each tube. Thoroughly resuspend the cells by vortexing
or repeatedly pipetting up and down.
3. Incubate tubes at 37°C for 30–60 min with shaking at 200-250 rpm.
[Optional] Check a drop of the cell suspension under a phase contrast microscope (400X) for the progress of
cell lysis by adding a drop of 20% SDS to the side of the coverslip. As they come into contact with the SDS, most
cells should lose their refractile appearance and appear as "ghost-like" spheroplasts. If there are still many intact
cells present, incubate the samples for another 30 min.
4. Add 10 ml of 20% SDS to each tube and vortex vigorously for 1 min to mix.
5. Put the samples through one freeze/thaw cycle (at –20°C) and vortex again to ensure
complete lysis of the cells.
6. If necessary, samples can be stored frozen at –20°C. If samples have been frozen, vortex
them again before using them.
7. Pour the entire contents of the tube from Step 5 above onto a prespun CHROMA SPIN-
1000 Column and purify the plasmid DNA according to the CHROMA SPIN User Manual.
Purified plasmid DNA will elute from the column.
If you do not use CHROMA SPIN Columns, clean up the prep as follows:
a. Bring the volume of the sample up to 200 ml in TE buffer (pH 7.0).
b. Add 200 ml of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1).
c. Vortex at highest speed for 5 min.
d. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.
e. Transfer the aqueous (upper) phase to a fresh tube.
f. Add 8 ml of 10 M ammonium acetate and 500 ml of 95–100% Ethanol.
h. Place at –70°C or in a dry-ice/ethanol bath for 1 hr.
i. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.
j. Discard supernatant and dry the pellet.
k. Resuspend pellet in 20 ml of H2O.
Note: The amount of plasmid DNA recovered is small relative to the contaminating genomic DNA;
therefore, it cannot be measured by A260 or seen on an agarose gel.
另外：酵母菌落PCR方法
Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法
模板的处理：
1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；
2.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit中已有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；
3.用半根灭菌的牙签（节约，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5毫升离心管，对PCR管和1.5毫升离心管编号；
4.PCR扩增，1％ 琼脂糖凝胶电泳；
5.对于PCR扩增显现特异性条带的克隆，把置于1.5毫升离心管中的半截牙签扔到5毫升YPDZ培养基中，30度培养，8－12小时后提质粒，酶切鉴定确认。
PCR反应体系：
以TaKaRa Taq DNA聚合酶反应为例，引物为5´ AOX1 primer，3´AOX primer：
组分 20μl体系
10xReaction Buffer 2.0μl
dNTP 1.6μl
Primer 1（20pmol/L） 0.5μl
Primer 2（20pmol/L） 0.5μl
ddH2O 15.2μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl
TOTAL 20.0μl
PCR反应条件：
初始变性 94℃ 4min 1
变性 94℃ 30s 30个循环
退火 50~54℃ 30s
延伸 72℃ 30s
结束延伸 72℃ 10min 1
保存 4℃ 1
如果筛选的是Mut+，将会出现两条带，一个是目的基因，另一个是2.2kb的AOX1基因，空质粒会出现以下条带（pPICZαA 588 bp)，将两者的大小加在一起来解释出现的实验结果。
我的结果是空载体的有大约580多的条带，但重组子的PCR只有将近1000bp的条带（我的目的基因是400bp），没有2.2kb的条带。
6其它一法：
1.Transfer 1.5 ml of liquid culture of yeast grown for 20 – 24 h at 30°C in YPD (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose) into a microcentrifuge tube. Pellet cells by centrifugation at 20,000 × g for 5 minutes.
2. Add 200 μl of lysis buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0).
3. Immerse tubes in a dry ice-ethanol bath for 2 minutes, transfer to in a 95°C water bath for 1 minute. Repeat; vortex 30 seconds.
4. Add 200 μl of chloroform; vortex 2 minutes.
5. Centrifuge 3 minutes, room temperature, 20,000 × g.
6. Transfer the upper aqueous phase to a microcentrifuge tube containing 400 μl ice-cold 100% ethanol. Mix by inversion or gentle vortexing.
7. Incubate at room temperature, 5 minutes. Alternatively, precipitate at -20°C to increase yield.
8. Centrifuge 5 minutes, room temperature, 20,000 × g. Remove supernatant with a pulled Pasteur pipette by vacuum aspiration.
9. Wash the pellet with 0.5 ml 70% ethanol, spin down as described in step 8 above. Remove supernatant.
10. Air-dry the pellets at room temperature or for 5 minutes at 60°C in a vacuum dryer.
11. Resuspend in 25–50 μl TE [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)] or water. Samples obtained directly from plates should be resuspended in a 10 μl volume。
酵母表达外源蛋白的注意点和相关检测
1、
用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
2、温度：
在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。
3、pH
手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。pH3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。
4、偏爱密码子
codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。
5、表达时间与空质粒转化对照
诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照，这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。
6、污染
每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。
污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。
7、不表达
蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。
8、表达量
30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。
9、糖基化
酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1－3KD左右的糖基。另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。
10、表型与表达
重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。
11、培养基
YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。
BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。
YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。
小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。
如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。
用无机盐进行大规模发酵，更省钱。
大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。一个批次100h左右估计3－4瓶氧气。
关于Tryptone和Peptone的选择：
1）用培养E.coli的Tryptone替代Peptone对有些酵母菌可以,例如一般的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的AH109,Y187之类表达酵母，根本就长不好．
2）Tryptone和Peptone虽然都是营养胨，但营养成分不一样．即使是一般的表达酵母可以在Tryptone生长，生长状态也没有在Peptone中好．但tryptone和peptone就是含量上有点不同外，其他没什么区别，用peptone的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB。
3）如果要求不高，一般使用也还凑合．尽可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌．
4）用含Peptone的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。而改用Tryptone后，培养基颜色变得很浅，和LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。invitrogen说明书说 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。
培养毕赤酵母,书上说BIOTIN储液是水溶液,但事实上BIOTIN很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：
1）、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；
2）、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；
3）、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）。所以肯定要加的。
附：无机培养基配方
BSM无机培养基：
85% H3PO4 26.7ml/L
CaSO4 •2H2O 0.93g/L
K2SO4 18.2g/L
MgSO4•2H2O 14.9g/L
KOH 4.13g/L
甘油 40g/L
PMT1 4.0ml/L
100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸铵调pH5.0，氨水用于上罐调pH（便宜，方便）。诱导表达前调pH6.0。pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HSA融合蛋白的最适pH。
BSM高压灭菌后再加4.0ml/L 过滤除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml PMT1，用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。
PMT1（1L）配方：
CuSO4•5H2O 6.0g/L
KI 0.088g/L
MnSO4•H2O 3.0g/L
Na2MoO4•2H2O 0.2g/L
H3BO3 0.02g/L
CoCl2•6H2O 0.5g/L
ZnCl2 20.0g/L
FeSO4•7H2O 65.0g/L
Biotin 0.2g/L
浓H2SO4 5.0ml
12、蛋白降解
分泌表达的目标蛋白比胞内蛋白确实容易被降解。可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。
Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the P.pastoris culture medium.
1）、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one or more problem proteases.
2）、The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.
3）、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that portease activity is induced under nitrogen starvation.
The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.
连续两个或两个以上的碱性氨基酸相邻的结构，如果有的话，在这一位点是很容易被蛋白酶切断，产生偏小的多肽。
13、换液
通常用BMGY和BMMY是要换液的，但也可以不用换液。培养到菌液浑浊后，直接向BMGY里加甲醇诱导就行了。GS115在第4天达到了最高表达量。换液不是必要的，适量甘油的存在有时反而会使表达量提高，
10ml生长培养后，等体积换液。我用250三角瓶，装量25mlBMGY发酵2天，再取0.5ml加入BMMY（250三角瓶，装量25ml)中诱导发酵.
BMGY和BMMY的换液方式有2种：
1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。另外2）一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。
总之，无论是取样还是补料、加甲醇，尽量用灭菌的移液管（因为比较长，不容易引起污染）。当然，微量的如200ul，还是用移液器加（快而准确），可以在瓶口处往瓶内加入100％甲醇等。用新开启的分析纯甲醇，我们都没有过滤或者其他处理，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。实验室里也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。
14、上罐表达
放罐时OD能达到400左右，生长过程最高OD500左右，重组蛋白发酵水平大约300-400mg/L。30g/L甘油初始培养OD约40左右，流加约420g/L甘油后，菌体密度达到最高约500。开始诱导后，起初3－5h之内流加的甲醇很少，发酵体积变化小，但是菌体的OD值是快速下降的，一般是原来的90%左右，每次都是这样，确切原因我们也还不清楚，估计是酵母从高速生长转向营养饥饿过程中，菌体形态发生很大变化，比如大小、含水量、折光率等。随酵母逐渐适应利用甲醇为碳源，mut＋型酵母的诱导可以将甲醇的流速逐步提高，此时仍然能发现OD值下降，我们认为这主要是发酵体积增加的原因造成的。我们诱导过程一般增加约40%的体积7L到10L，最终OD值约为最高OD值的80%左右，简单换算一下，应该知道菌体生物量增加约1/7。其实，这和毕赤酵母代谢甲醇途径也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分继续氧化成甲酸进而生成CO2，产生菌体所需的能量，另一部分可以被菌体同化，进入小分子碳架的合成途径，提供菌体生长所需的碳源。
15、菌体密度：
菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。
麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。
如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10——1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。
通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。
摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。
17、菌种保存
用15%甘油做保护剂，-70度长期保存，-20度短期保存使用。不过要注意冻存前一定充分混匀，酵母菌体很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。
一般OD2-6的YPD过夜菌吸取300ul菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀，放于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱。
重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。这在用动物细胞表达系统如CHO，NS0系统更为明显，所以一定要保存好最原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆表达，尽量减少菌株传代次数。不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株。
GS115的鉴定方法
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。GS115的his4基因突变了，不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含基本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变。
