我国是啤酒生产大国,目前啤酒年产量已达到2000万ｔ,仅次于美国居世界第2位。生产啤酒的废弃啤酒酵母排放量约占啤酒产量的3%,即60万ｔ左右。啤酒废酵母的主要成分是活性啤酒酵母,还含有少量杂质。啤酒废酵母浑身是宝,它含有50%左右的蛋白质,6%～8%的核糖核酸(ＲＮＡ),2%的Ｂ族维生素,1%的谷胱甘肽及辅酶Ａ,还含有氨基酸等多种成分,是一类可以加以利用的巨大财富[1]。啤酒废酵母菌体自溶技术,就是借酵母菌体内的内源酶(蛋白酶、核酸酶、碳水化合物水解酶等)将菌体的高分子物质水解成小分子而溶解出菌体外的过程。在自溶物中含有原有菌体的碎片和自溶时降解出来的可溶性物质,其中包括游离氨基酸、核苷酸、肽、糖分、Ｂ族维生素、麦角甾醇及各种香味成分[2～4]。聚β 羟基丁酸酯(ＰＨＢ)是一类由微生物合成的,具有生物可降解性、生物相容性、压电性等许多独特优点的高分子功能材料,它在医药、电子、农业生产和包装材料等许多领域都具有潜在的良好应用前景。但是ＰＨＢ的高成本却限制了它的大规模生产和普遍应用。为了降低ＰＨＢ的生产成本,本课题组成功构建了同时携带透明颤菌血红蛋白基因(ｖｇｂ)、λ噬菌体裂解基因(Ｓ ＲＲｚ)和ＰＨＢ合成基因(ｐｈｂＣＡＢ)的重组大肠杆菌ＶＧ1(ｐＴＵ14),并以酵母浸粉为有机氮源,淀粉水解糖为碳源,实现了ＰＨＢ的高密度生产[5～8]。在此基础上,为进一步降低ＰＨＢ的生产成本,本研究对采用廉价的废酵母自溶液为有机氮源替代酵母浸粉的可行性进行了探索。
1 材料和方法
1.1 实验装置与材料
ＧＳＹ Ⅱ电热恒温水浴锅;500ｍＬ,1000ｍＬ锥形瓶;ＪＪ 1精密定时电动搅拌器;100℃温度计。酵母泥(啤酒废酵母);安琪牌鲜酒酵母;ＮａＣｌ;甲苯;乙酸乙酯;去离子水;ＮａＯＨ溶液和Ｈ2ＳＯ4溶液(调ｐＨ用)。实验菌株为重组Ｅ ｃｏｌｉＶＧ1(ｐＴＵ14)。
1.2 实验方法
水浴锅预热至55℃;准确称量酵母(除特别指出外,均为300ｇ),放入烧杯,按比例加入水、ＮａＣｌ、甲苯等自溶促进剂;放入水浴,用塑料薄膜封口,搅拌,至自溶液温度稳定,用ＮａＯＨ调ｐＨ到指定值,开始计时;每隔一定时间,取少量自溶液离心(5000ｒ/ｍｉｎ,10ｍｉｎ),测上清液中氨基氮浓度,作出氨基氮浓度时变曲线;至氨基氮含量基本不再上升时停止反应,离心分离,上清液放入清洁储罐,调ｐＨ至偏酸(5.0左右),105℃、15ｍｉｎ消化自溶酶,冷却后抽滤;测定滤液中的氨基氮浓度,计算加液量,配制ＶＧ1(ｐＴＵ14)的培养基。
1.3 分析方法
氨基氮分析采用甲醛滴定法;
细胞生长情况测定,采用分光光度法;
菌浓测定,采用干重法;
ＰＨＢ的显微观察采用结晶紫染色法;
ＰＨＢ含量测定,采用浓硫酸降解法[5]。
2 结果与讨论
2.1 自溶条件优化
为方便实验的进行,本研究首先采用安琪牌鲜酒酵母进行酵母自溶规律与自溶液应用可行性研究。最后再用废啤酒酵母验证。准确称取酵母的湿重,在60℃烘箱中干燥至衡重,称干重,计算干物质的含量。5次测量的平均结果表明,鲜酒酵母的干物质含量为34.1%,平均水分含量为65.9%。废酵母则略有不同,干物质含量仅为22.0%,平均水分含量为78.0%。在酵母自溶过程中,自溶温度是一个很重要的参数。温度太低不利于蛋白酶发挥作用,而且自溶过程中容易腐败变质。温度过高,酶失活。因此一般控制在40～60℃[9]。在本研究中,为保证最好的自溶效果,选用了55℃。除温度外,自溶反应ｐＨ、加水比、质壁分离促进剂等因素对自溶反应也均具有重要影响,为此本文对其一一研究。
2.1.1 自溶反应最适ｐＨ的确定
酵母自溶是由酵母本身所含的酶参与进行的,酵母细胞内含有多种酶,ｐＨ值影响这些酶的活性,从而影响细胞和蛋白质的降解程度,即ｐＨ的变化会影响蛋白质及氨基酸的溢出。据报道,酵母细胞自溶的最适ｐＨ一般在5～8之间[1]。在此范围内,设计5.5,7.0,8.0三个ｐＨ值,实验中加入6.67ｍｇＮａＣｌ/ｇ鲜酵母。用4ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ和/或2ｍｏｌ/ＬＨ2ＳＯ4调ｐＨ到指定数值。每2ｈ取样1次,测其离心液氨基氮浓度,得到图1。反应后,测自溶液ｐＨ值,均下降到5.5左右。
由图1可见,自溶液起始ｐＨ在8.0时自溶效果最差,自溶液中氨基氮浓度最低。初始ｐＨ值在7.0左右时,在数小时内自溶液的ｐＨ可自然下降到7.0以下,这一方面是由于废弃酵母本身呈酸性,另一方面是由于蛋白质降解产生氨基酸,特别是酸性氨基酸所致。此时,自溶酶综合活性最强,自溶速度最快,效果最好。因此,在后面的实验中初始ｐＨ均控制为7.0。
2.1.2 加水比对自溶反应的影响
在酵母自溶之前,需加入一定的水(必须是清洁卫生的饮用水),将酵母泥调配成悬浮液,以将离心所得的致密的酵母泥分散开,有利于酵母细胞的搅拌、分散和恒温,胞内酶自溶作用的进行以及自溶产生的可溶性化合物的抽提溶解。加水比小,氨基酸溶出阻力大,影响酵母自溶,从而影响到氨基氮的产量及收率。加水比大,用水多,氨基氮的收率高,但产品浓度低,浓缩时的能耗大,且成品中盐量也会高。超过一定的加水比,则单位干酵母氨基氮溢出量处于平衡,溶出氨基氮总量不再增加,只会增加浓缩和干燥时的能耗[10]。在不同加水比条件下进行自溶反应,以氨基氮总量(总氨基氮含量=氨基氮浓度×自溶液体积)为指标,考察加水比的影响,如图2。
由图2可以明显地看出,增大加水比后,自溶反应速度大大提高,产品中总氨基氮含量增加,自溶效率有所提高。但加水比在5∶1以上时,总氨氮含量随加水比增大而增大的幅度变小。进一步考察最终产品的氨基氮浓度可以发现,增大加水比将导致产品氨基氮质量浓度下降(3.82,3.42,2.45,2.25ｇ/Ｌ)。酵母自溶原料来源便宜,而浓缩费用较高,增加反应时间造成的成本提高与浓缩费带来的成本提高相比可能前者较少,且在浓缩过程中氨基氮损失也会较多。综合考虑,在本研究选用了4∶1的加水比。
2.1.3 加盐量对自溶反应的影响
在ＮａＣｌ含量较高的介质中,酵母细胞为了和介质达到渗透压平衡而失去水分,在极端条件下,膜内的原生质成分大部分通过膜脱离细胞壁,形成了质壁分离。质壁分离现象持续一段时间后就会导致细胞死亡,引发细胞的降解过程。此外,ＮａＣｌ还具有杀菌、防腐、调味、除臭作用,且价廉、易得,是理想的质壁分离剂。但是过量的ＮａＣｌ会限制产品在食品工业中的应用,因为低钠提取物更受欢迎;过量ＮａＣｌ还可能抑制内源酶的活性,影响自溶速度[4]。为考查ＮａＣｌ对本自溶实验影响,在不同加盐比条件下(按干物质计算),进行13～15ｈ自溶反应,得到结果如图3所示。
随食盐用量增加,氨基酸溶出速度和效率均有所提高,但变化并不明显。食盐用量加大1倍,氨基氮浓度提高约8%。由图3分析,ＮａＣｌ加入量在0～3.5%的范围内变化时对自溶反应影响不大。由于产品最终用于微生物培养基,含盐量过高将影响菌体生长,且增加产品成本。综合以上考虑,在本自溶体系中不加入食盐。
2.1.4 自溶促进剂的选择与优化
甲苯作为有机溶剂是一种常用的自溶促进剂,它可以溶解细胞壁上的酯蛋白,增加细胞壁的通透性,帮助胞内物溶出。以干物质计算,按不同比例加入甲苯进行自溶反应,结果如图4所示。由图4可见,不加甲苯时,自溶反应的初始速度很慢,后期虽有所提高,但自溶的总体效果仍然很差;甲苯加入量为3%左右时自溶效果较好。此时,初始自溶速度较快,在短时间内可以达到较高的氨基酸浓度。甲苯加入3%以上时,随甲苯加入量的增加,自溶效果反而变差。因此,确定最佳甲苯加入量为3%。
然而,由于甲苯的沸点为110.6℃,因此在自溶液的后期处理中不能被完全挥发。在后期以添加甲苯的酵母自溶液对重组大肠杆菌ＶＧ1(ｐＴＵ14)进行培养时发现,随着自溶过程中甲苯用量的增大,及甲苯残留量的增多,ＶＧ1(ｐＴＵ14)经48ｈ培养收获的细胞浓度和ＰＨＢ含量均较大幅度下降(如图5所示)。又由于甲苯有毒,因此应该选用其他的自溶促进剂来替代甲苯。
经过研究,本文选用与甲苯功能类似,但沸点低(77.2℃),毒性小的乙酸乙酯作为自溶促进剂。在3.3%加入水平下,对比乙酸乙酯和甲苯对自溶反应的影响,结果表明(见图6),二者作用相似,尤其自溶到10ｈ以上时,2条曲线几乎重合。因此,乙酸乙酯可以替代甲苯。进一步优化乙酸乙酯的用量,发现当加入约3%的乙酸乙酯时,自溶液氨基氮浓度提高22.6%(如图7所示)。
总之,以安琪牌鲜酒酵母为对象,在自溶温度为55℃时,最终确定了初始ｐＨ7.0,加水比4∶1,不加ＮａＣｌ,并以3%的乙酸乙酯替代甲苯作为自溶促进剂的自溶反应条件。
2.2 用废啤酒酵母生产酵母自溶液
采用上述自溶反应条件,对南通某啤酒厂的废啤酒酵母进行自溶处理。取废啤酒酵母泥(由于废啤酒酵母中含有啤酒花,啤酒花的杀菌作用会影响细菌生长,因此在自溶前要先对废啤酒酵母进行预处理,用洗涤、过滤的方法除去其中的啤酒花成分,再进行自溶反应,生产自溶液)400ｍＬ(约500ｇ),加入400ｍＬ水,加乙酸乙酯(自溶促进剂)4.5ｍＬ,初始ｐＨ为7.0,反应温度55℃,自溶15ｈ后,获得的氨基氮浓度为4.95ｇ/Ｌ。在相同条件下(干物质重量相同),用鲜酵母自溶15ｈ后氨基氮浓度仅为3.52ｇ/Ｌ。由此可见,与鲜酒酵母相比,废啤酒酵母更易自溶,可以达到更高的氨基酸浓度,这是由于啤酒酵母发酵产酒后的废酵母中含有乙醇,乙醇本身就是很好的自溶促进剂,因此酵母细胞壁上的脂蛋白有可能已被大量溶解,使细胞壁的渗透性更好。继续延长自溶时间,20ｈ后,氨基氮浓度达到6.03ｇ/Ｌ。将沉淀后得到的酵母残渣清洗,离心,上清液作为母液代替去离子水继续用于废酵母的自溶,条件如上,18ｈ后,自溶液氨基氮浓度达到7.5ｇ/Ｌ。如果进一步优化自溶条件,延长反应时间,有可能进一步提高产品浓度。
2.3 以酵母自溶液为有机氮源培养产ＰＨＢ
重组大肠杆菌ＶＧ1(ｐＴＵ14)为了考察以酵母自溶液作为有机氮源时,重组菌ＶＧ1(ｐＴＵ14)的细胞生长和ＰＨＢ积累效果,分别以相同氨基氮浓度的Ｏｘｏｉｄ进口酵母浸粉和酵母自溶液为有机氮源,采用ＶＰＹ培养基对ＶＧ1(ｐＴＵ14)进行摇瓶对照培养。48ｈ后收获菌体,进行菌浓与ＰＨＢ含量分析。结果如表1所示。其中,由于自溶促进剂乙酸乙酯可能对微生物的生长具有毒性,因此在考察酵母自溶液使用效果的同时,还考察了乙酸乙酯残留对微生物生长的影响。由表1可见,当以酵母自溶液为有机氮源替代酵母浸粉时,无论原料中是否含有乙酸乙酯,收获的菌浓、ＰＨＢ浓度和ＰＨＢ含量均有提高,因此其微生物培养的效果优于酵母浸粉。在培养过程中,进一步观察以酵母自溶液为有机氮源时,菌体细胞形态的变化和ＰＨＢ的积累情况,结果如图8所示。
由图8可见,采用酵母自溶液作为有机氮源对ＶＧ1(ｐＴＵ14)进行培养时,细胞生长和ＰＨＢ积累同步进行。当培养到48ｈ时,白色的ＰＨＢ颗粒已经充满了大部分细胞;继续培养到65ｈ,部分细胞裂解,释放出胞内的ＰＨＢ。这些现象与采用酵母浸粉为有机氮源生产ＰＨＢ时完全相同[5]。从上述结果看出,酵母自溶液可以完全替代酵母浸粉作为有机氮源发酵培养ＶＧ1(ｐＴＵ14)。由于废啤酒酵母来源广泛,价格便宜,在工业生产中以废啤酒酵母为原料生产酵母自溶液简便可行,因此,在重组菌ＶＧ1(ｐＴＵ14)的大规模高密度培养生产ＰＨＢ的过程中,可以采用自制酵母自溶液作为有机氮源,以进一步降低原料成本。
总之,本文通过工业自溶装置的实验室模拟,建立了酵母自溶流程,优化了自溶条件。结果表明,自溶初始ｐＨ7.0为最佳;加水比不仅影响酵母细胞的自溶速度和自溶效率,而且影响自溶产品的氨基氮浓度,最佳加水比的确定取决于具体的经济核算。食盐的少量加入对自溶有促进作用,但影响很小。甲苯加入虽然能够促进自溶反应,但对后期的微生物生长不利,因此应以功能类似,但沸点低,毒性小的乙酸乙酯替代。乙酸乙酯的优化用量为3%～4%。进一步以自制的酵母自溶液对重组大肠杆菌ＶＧ1(ｐＴＵ14)摇瓶培养,酵母自溶液可以成功替代酵母浸粉作为有机氮源来发酵生产ＰＨＢ。这种以廉价酵母自溶液作为有机氮源进行微生物发酵的策略,在其他生化产品的低成本工业化生产中,也具有非常重要的应用价值。
