技术领域
本发明涉及一种生物农药的发酵生产，尤指一种中生菌素发酵连续补料生产装置及其生产方法。
背景技术
根据联合国粮农组织（FAO）的统计，全世界农林生产过程中；每年因病虫草害所造成的损失在三分之一以上。全世界每年大约发生300万起化学农药中毒事件。在发展中国家，全球每年因食用农药污染食品引起集体中毒事件大约 1650起。因此，大力发展安全、低毒和无毒、低蓄积和无蓄积、不污染环境的生物农药已成为必然的趋势和全球共识。中生菌素是一种新型农用抗生素类生物农药，其应用属于杀菌剂类别，用于防治农作物病害。它的产生菌是从我国海南岛的土壤中分离得到，命名为淡紫灰链霉菌海南变种（Strepromyceslavenduae hainanensis n.var）。作为一种农用抗菌类生物农药对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和丝状真菌具有强烈的抑制或杀灭作用。对水稻白叶枯病，白菜软腐病，苹果轮纹病和苹果叶斑病等具有良好的防效。但对人畜类低毒安全，与环境相容友好性。中生菌素（化学名：1―N甙基链里定基―2―氨基L―赖氨酸―2脱氧古罗糖胺；分子式：C19H34O8N8；分子量：502.0）正是具有高效低毒、低蓄积、无残留的特点，其通过抑制病原细菌蛋白质的肽键生成，最终导致细菌死亡；对真菌可抑制菌丝的生长、抑制孢子的萌发，起到防治真菌性病害的作用；是无公害果树、蔬菜生产基地的必备用药。广泛应用于防治水稻白叶枯病、苹果轮纹病、白菜软腐病等。因此，开发一种中生菌素发酵连续补料生产装置及生产方法、降低能耗、提高中生菌素发酵生产水平，进而提高中生菌素产量具有良好的经济与社会效益。
中生菌素是以淡紫灰链霉菌海南变种为产生菌，黄豆饼粉、玉米淀粉、玉米粉、葡萄糖、碳酸钙、氯化钠、氯化铵、硫酸镁、谷氨酸、精氨酸、片碱等为主要原料经过发酵培养得到的次级代谢产物。目前中生菌素发酵的主要方法为：中生菌素产生菌摇瓶种子培养 →接种到种子罐扩大培养 → 接种到发酵罐发酵培养产生中生菌素，在50小时~240小时的发酵周期中进行一至五次的间歇补料。
目前工艺存在不足之处：
1、目前的补料培养基采用业内公知的湿热灭菌方法，由于湿热灭菌要达到121℃、30分钟的灭菌维持时间，致使补料培养基处于80℃以上的高温过程要长达60分钟以上时间，造成补料培养基在长时间高温后外观发红或呈现褐色，补料培养基的营养物质被破坏，甚至产生对中生菌素产生菌有毒害的物质，影响中生菌素发酵水平的提高。
2、目前的补料工艺为间歇大量补料，造成发酵罐内培养基组分波动较大，给中生菌素产生菌的微生长环境造成极大的影响，不利于产生菌的生长及次级代谢产物的增长。
3、目前的发酵过程间歇大量补料，易形成业内公知的葡萄糖效应，造成对次级代谢产物生成的抑制而影响中生菌素产量的增长。
4、目前的间歇大量补料使得发酵前中期营养过剩，大量繁殖菌体；中后期营养不足，无法进一步提高中生菌素发酵水平，发酵液内中生菌素含量徘徊在8.00g/L—10.00g/L之间。
5、目前的间歇大量补料工艺需要消耗大量的蒸汽进行多次补料培养基消毒以及多次补料管道的消毒，员工劳动强度大并造成大量能源消耗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种中生菌素发酵连续补料装置及其生产方法，通过该连续补料装置及其生产方法可以提高中生菌素发酵生产水平；减轻员工的劳动强度；还可以减少蒸汽使用量实现节能降耗。
为解决上述问题，本发明的技术解决方案是：
1、一种中生菌素发酵连续补料生产装置，包括除菌过滤系统、流量计及补料培养基配制输送系统。
（1）、所述连续补料装置的除菌过滤系统的出口通过管道与发酵罐补料管道进口连接，除菌过滤系统的进口通过管道与流量计出口连接，流量计进口通过管道与补料培养基配制输送系统的出口连接。
（2）、所述除菌过滤系统由2个过滤精度为0.22μ的液体精滤器及一个精度为0.45μ的液体预滤器通过管道串联而成，液体预滤器为除菌过滤系统的进口端，除菌过滤系统进口管道由第一三通及管道连接第一阀门和第二阀门。
（3）、所述除菌过滤系统进口与流量计出口之间由第一阀门经管道连接。
（4）、所述流量计进口经管道连接第二三通出口。
（6）、所述连接流量计进口的第二三通的进口通过管道连接补料培养基配制输送系统的打料泵的出口。
（7）、所述打料泵的进口通过管道连接第三三通的出口。
（8）、所述连接打料泵进口的第三三通的一个进口通过管道连接第三阀门的出口，该第三阀门的进口通过管道与第一补料培养基配料罐底部连接。
（9）、所述连接打料泵进口的第三三通的另一个进口通过管道连接第四阀门的出口，该第四阀门的进口通过管道与第二补料培养基配料罐底部连接。
（10）、所述连接流量计进口的第二三通的另一个出口通过管道连接一个第四三通的进口；该第四三通的两个出口通过管道各自连接第五阀门和第六阀门，第五阀门和第六阀门都各自连接一条管道对应回到各自的补料培养基配料罐内。
2、一种中生菌素发酵连续补料的生产方法，包括下述工艺过程：
（1）、除菌过滤系统及关联的连通管道的灭菌：使用业内公知的实罐消毒灭菌的方法对发酵罐内培养基消毒灭菌的同时，对2个精度0.22μ的液体精滤器、1个精度0.45μ的液体预滤器及关联的连通管道进行活蒸汽消毒灭菌。
（2）、除菌过滤系统及关联的连通管道灭菌后的保压：灭菌结束利用发酵罐内的无菌空气对2个串联的精度0.22μ的液体精滤器、1个精度0.45μ的液体预滤器及关联的连通管道进行灭菌后的正压保持。
（3）、补料培养基的配制：将一定比例的葡萄糖、氯化钠、氯化铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、谷氨酸、溶配后的精氨酸在两个补料培养基配料罐内加饮用水搅拌，完全溶解、配制成一定的浓度。
（4）、补料：将第一补料培养基配料罐内一定浓度的补料培养基用打料泵输出，经过流量计、1个精度0.45μ液体预滤器、2个精度0.22μ的液体精滤器除菌后，达到无菌的补料培养基补加进发酵罐内。
（5）、补料培养基回流：为控制补料培养基的流量，打料泵输出的补料培养基部分经回流管流回至第一补料培养基配料罐内。
（6）、连续补料：2个补料培养基配制罐交替配料、补料，通过补料系统第三阀门和第四阀门的切换控制实现对发酵罐的少量多次的间歇补料或连续流加补料。
所述1个精度为0.45μ液体预滤器、2个精度为0.22μ的液体精滤器及关联的连通管道的灭菌，为每批发酵罐培养基灭菌时都同步进行。
所述精度0.45μ液体预滤器滤芯材质、精度0.22μ液体精滤器滤芯材质都可耐受使用蒸汽实现121℃、30分钟灭菌达到数十次。
所述精度0.22μ液体精滤器滤芯的材质为PES（聚醚砜）、NL（尼龙6）、PTFE（聚四氟乙烯）、PVDF（聚偏二氟乙烯）。
所述精度0.45μ液体预滤器滤芯的材质为PES（聚醚砜）、NL（尼龙6）、PTFE（聚四氟乙烯）、PVDF（聚偏二氟乙烯）、PP（聚丙烯）。
所述补料培养基的配制为将补料用葡萄糖、氯化钠、氯化铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、谷氨酸、溶配后的精氨酸投入盛有一定量饮用水的补料培养基配料罐内，搅拌使补料培养基充分溶解，补加饮用水，将补料培养基配料罐内的补料培养基定容至分别含葡萄糖0.00%—35.00%、含氯化钠0.00%—5.00%、含氯化铵0.00%—6.00%、含硫酸镁0.00%—6.50%、含磷酸二氢钾0.00%—3.50%、含谷氨酸0.00%—6.50%、含精氨酸0.00%—7.50%。
所述连续补料为发酵罐内的还原糖浓度≤2.50%时，将第一补料培养基配料罐内配制好的补料培养基通过打料泵输出经过流量计、1个精度0.45μ液体预过滤器、2个精度0.22μ液体精滤器除菌过滤进入发酵罐内，维持发酵罐内的还原糖浓度在0.50%—2.50%之间。
所述补料培养基回流为保证补料培养基按照需要的流量进入发酵罐内而将打料泵输出富余的补料培养基通过旁通管道返回原补料培养基配料罐内。
所述连续补料为保证发酵罐内还原糖的浓度维持在一个浓度区间，可随时进行少量多次间歇补加更可持续不断地连续补加饮用水或≥1种不同配比的补料培养基进入发酵罐的过程，利用2个补料培养基配料罐交替使用，根据工艺需求灵活掌握补料种类、补料速度及补料时间，补料时间可以从发酵刚开始的“0”小时至发酵结束放罐的全过程。
采用上述方案后，本发明与现有工艺技术相比具有如下显著特点：
1、本发明的中生菌素连续补料的补料培养基不需要蒸汽的湿热灭菌，减少了补料培养基因高温湿热灭菌造成的破坏及形成对中生菌素产生菌有害的物质。
2、所述连续补料可以维持中生菌素发酵过程中发酵液微环境的相对稳定，避免因间歇大量补料造成发酵液微环境的变化，影响或改变中生菌素产生菌正常代谢途径。
3、所述连续补料可以控制发酵液葡萄糖的浓度，避免高浓度的葡萄糖对中生菌素产生菌产生中生菌素造成不利的抑制影响，有利于延长中生菌素产生菌次级代谢的时间，提高中生菌素发酵水平。
4、所述连续补料可以根据工艺需求灵活掌握中生菌素发酵补料培养基种类、补料速度及补料时间，实现发酵过程的精准控制。
5、本发明的中生菌素连续补料培养基不需要蒸汽的湿热灭菌，节约了大量的补料培养基消毒灭菌及间歇大量补料需要的补料管道多次消毒灭菌的蒸汽，同时降低了员工的劳动强度，节约了人力与物力，具有良好的经济与社会效益。
附图说明
图1是本发明中生菌素发酵连续补料装置及其生产方法示意图：
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详述。
本发明所揭示的是一种中生菌素发酵连续补料生产装置，如图1所示、为本发明所述中生菌素发酵连续补料生产装置示意图。所述的中生菌素连续补料的生产装置包括：发酵罐1、液体精滤器2、液体精滤器3、液体预滤器4、第二阀门5、第一阀门6、流量计7、第五阀门8、第六阀门9、第一补料培养基配料罐10、第二补料培养基配料罐11、第三阀门12、第四阀门13、打料泵14。其中：该发酵罐1的进口与液体精滤器2的出口通过管道连接，该液体精滤器2的进口与液体精滤器3的出口通过管道连接，该液体精滤器3的进口与液体预滤器4的出口通过管道连接，该液体预滤器4的进口与第二阀门5的进口和第一阀门6的出口通过管道连接，该第二阀门5的出口通过管道连接排空，该第一阀门6的进口与流量计7的出口通过管道连接，该流量计7的进口与打料泵14的出口以及第五阀门8和第六阀门9的进口通过管道连接，该第五阀门8的出口通过管道进入第一补料培养基配料罐10内，该第六阀门9的出口通过管道进入第二补料培养基配料罐11内，该第一补料培养基配料罐10的出口与第三阀门12的进口通过管道连接，该第二补料培养基配料罐11的出口与第四阀门13的进口通过管道连接，该第三阀门12的出口以及第四阀门13的出口与打料泵14的进口通过管道连接。
本发明还揭示一种中生菌素发酵连续补料生产方法，如图1所示、该生产方法的工艺过程为：
（1）液体精滤器2、液体精滤器3、液体预滤器4的消毒灭菌：以业内公知的蒸汽消毒灭菌的方法对发酵罐内培养基进行分批灭菌的过程中，关闭第一阀门6、微微开启第二阀门5、保证液体精滤器2、液体精滤器3、液体预滤器4、第二阀门5有活蒸汽充满并控制流量排出，达到121℃、30分钟的消毒灭菌的温度与维持时间。
（2）液体精滤器2、液体精滤器3、液体预滤器4的无菌保压：发酵罐内培养基灭菌结束后以无菌空气维持罐体压力≥0.02Mpa，同时关闭第二阀门5，并在整个发酵过程中维持发酵罐压力≥0.02Mpa，维持液体精滤器2、液体精滤器3、液体预滤器4的压力≥0.02Mpa。
（3）补料培养基配制一：关闭第三阀门12，在第一补料培养基配料罐10预先打入一定量的饮用水，投入预先按比例称量好的补料培养基，开启搅拌，补加饮用水，确保第一补料培养基配料罐10内的补料培养基完全溶解并达到所需的容积及配比浓度。
（4）补料培养基配制二：关闭第四阀门13，在第二补料培养基配料罐11预先打入一定量的饮用水，投入预先按比例称量好的补料培养基，开启搅拌，补加饮用水，确保第二补料培养基配料罐11内的补料培养基完全溶解并达到所需的容积及配比浓度。
（5）补料一：取样测定发酵罐内发酵液还原糖的数值，当发酵罐内发酵液的还原糖达到需要补料的范围时，开启第三阀门12，开启第五阀门8、关闭第六阀门9，关闭第四阀门13开启打料泵14使得第一补料培养基配料罐10内的补料培养基通过第三阀门12、打料泵14、第五阀门8得以循环；缓慢开启第一阀门6、调整第五阀门8的开启度，使得流量计7的流量达到补料工艺要求，维持发酵罐内培养基还原糖浓度在0.50%~2.50%。
（6）补料二：当第一补料培养基配料罐10内的补料培养基用完或工艺要求补加其他补料培养基时，切换使用第二补料培养基配料罐11内的补料培养基；开启第四阀门13，关闭第三阀门12，开启第六阀门9，关闭第五阀门8，维持打料泵14开启，调整第一阀门6及第六阀门9的开启度，使得流量计7的流量达到补料工艺的要求，维持发酵罐内培养基还原糖浓度在0.50%~2.50%。
（7）连续补料：根据发酵过程的补料工艺需要，按照步骤（3）、步骤（4）在第一补料培养基配料罐10、第二补料培养基配料罐11进行交替配制各种补料培养基；按照步骤（5）、步骤（6）切换输送第一补料培养基配料罐10或第二补料培养基配料罐11内的补料培养基连续补加到发酵罐内维持中生菌素发酵生产的需要。
（8）发酵结束，使用饮用水清洗2个补料培养基配料罐、打料泵、流量计、液体预滤器、2个液体精滤器及相关联的管道阀门，确保连续补料装置清洁待用。
下面通过具体实施例说明本发明中生菌素发酵连续补料的生产方法
实施例1
以30L发酵罐进行中生菌素发酵培养，发酵罐的连续补料装置在发酵罐内培养基消毒灭菌的同时进行消毒灭菌，中生菌素发酵培养过程中发酵罐的连续补料装置处于无菌保压状态。中生菌素发酵培养至15小时，测定发酵液中的还原糖含量为2.32%，开始补加含葡萄糖15.00%、含氯化钠0.50%、含氯化铵0.55%、含硫酸镁0.05%、含磷酸二氢钾0.01%的补料培养基。控制补料培养基流量为≤2.50L/h，每隔1小时测定中生菌素发酵液还原糖含量，控制该发酵液中还原糖含量在1.50%~2.00%，连续补料至发酵结束前10小时停止补料，发酵液继续发酵培养至发酵结束，发酵结束放罐，测定放罐发酵液还原糖含量为0.85%，放罐发酵液中生菌素含量11.33g/L。
实施例2
以30L发酵罐进行中生菌素发酵培养，发酵罐的连续补料装置在发酵罐内培养基消毒灭菌的同时进行消毒灭菌，中生菌素发酵培养过程中发酵罐的连续补料装置处于无菌保压状态。中生菌素发酵培养至25小时，测定发酵液中的还原糖含量为1.96%，开始补加含葡萄糖20.00%、含氯化钠0.55%、含氯化铵0.65%、含硫酸镁0.04%、含磷酸二氢钾0.01%、含谷氨酸0.03%、含精氨酸0.02%的补料培养基。控制补料培养基流量为≤2.50L/h，每隔1小时测定中生菌素发酵液还原糖含量，控制中生菌素发酵液中还原糖含量在1.30%~1.80%，连续补料至发酵结束前5小时停止补料，发酵液继续发酵培养至发酵结束，发酵结束放罐，测定放罐发酵液还原糖含量为1.05%，放罐发酵液中生菌素含量10.56g/L。
实施例3
以30L发酵罐进行中生菌素发酵培养，发酵罐的连续补料装置在发酵罐内培养基消毒灭菌的同时进行消毒灭菌，中生菌素发酵培养过程中发酵罐的连续补料装置处于无菌保压状态。中生菌素发酵培养至18小时，测定发酵液中的还原糖含量为2.15%，开始补加含葡萄糖35.00%、含氯化钠0.45%、含氯化铵0.55%、含硫酸镁0.03%、含磷酸二氢钾0.02%、谷氨酸0.05%、含精氨酸0.04%的补料培养基。控制补料流量为≤3.00L/h，每隔1小时测定中生菌素发酵液还原糖含量，控制中生菌素发酵液中还原糖含量在2.00%~2.50%，连续补料30小时；继续发酵至中生菌素发酵液还原糖降至1.30%~1.50%，开始补加含葡萄糖15.00%的补料培养基，控制补料培养基流量为≤3.00L/h，每隔1小时测定中生菌素发酵液还原糖含量，控制中生菌素发酵液还原糖含量在1.20%~1.60%之间，连续补料至发酵结束前8小时停止补料，发酵液继续发酵培养至发酵结束，发酵结束放罐，测定放罐发酵液还原糖含量为0.72%，放罐发酵液中生菌素含量12.21g/L。
实施例4
以30L发酵罐进行中生菌素发酵培养，发酵罐的连续补料装置在发酵罐内培养基消毒灭菌的同时进行消毒灭菌，中生菌素发酵培养过程中发酵罐的连续补料装置处于无菌保压状态。中生菌素发酵培养至10小时，测定发酵液中的还原糖含量为3.16%，开始补加不含任何其他原辅材料只含饮用水的补料培养基，控制补料培养基流量为≤3.50L/h，每隔1小时测定中生菌素发酵液还原糖含量，控制中生菌素发酵液中还原糖含量在2.00%~2.50%，开始补加含葡萄糖25.00%、含氯化钠0.55%、含氯化铵0.55%、含硫酸镁0.04%、含磷酸二氢钾0.02%、含精氨酸1.15%的补料培养基。控制补料培养基流量为≤3.50L/h，连续补料30小时，继续发酵至中生菌素发酵液还原糖降至1.10%~1.30%，开始补加含葡萄糖10.00%的补料培养基，控制补料培养基流量为≤3.50L/h，每隔1小时测定中生菌素发酵液还原糖含量，控制发酵液还原糖含量在1.00%~1.30%之间，连续补料至发酵结束前6小时停止补料，发酵液继续发酵培养至发酵结束，发酵结束放罐，测定放罐发酵液还原糖含量为0.81%，放罐发酵液中生菌素含量12.56g/L。
实施例5
以30L发酵罐进行中生菌素发酵培养，发酵罐的连续补料装置在发酵罐内培养基消毒灭菌的同时进行消毒灭菌，中生菌素发酵培养过程中发酵罐的连续补料装置处于无菌保压状态。中生菌素发酵培养至12小时，测定发酵液中的还原糖含量为2.88%，开始补加不含任何原辅材料只含饮用水的补料培养基。控制补料培养基流量为≤3.00L/h，每隔1小时测定中生菌素发酵液还原糖含量，控制中生菌素发酵液中还原糖含量在2.00%~2.50%，开始补加含葡萄糖30.00%、含磷酸二氢钾0.02%、谷氨酸0.86%、含精氨酸1.15%的补料培养基。控制补料培养基流量为≤3.00L/h，连续补料35小时，继续发酵至中生菌素发酵液还原糖降至1.30%~1.50%，开始补加含葡萄糖15.00%的补料培养基，控制补料培养基流量为≤3.00L/h，每隔1小时测定中生菌素发酵液还原糖含量，控制发酵液还原糖含量在0.80%~1.30%之间，连续补料至发酵结束前5小时停止补料，发酵液继续发酵培养至发酵结束，测定放罐发酵液还原糖含量为0.88%，放罐发酵液中生菌素含量11.88g/L。
所述发酵液还原糖含量的测定方法采用业内公知的发酵液还原糖含量测定方法。
所述发酵液中生菌素含量的测定方法为：
（1）生物测定：抗生素微生物检定法。
（2）菌悬液的试验菌：枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]。
所述示意图图1的补料培养基配料罐可以是2个及2个以上，供不同配方及不同浓度的补料培养基配制，以便发酵过程中灵活控制补加各种需要的补料培养基。
所述示意图图1的连续补料装置可以是1套及1套以上与同一发酵罐连接，实现各种单一或复合补料培养基同时灵活补料的功能。
所述示意图图1的连续补料装置可以拓展成在流量计前，以管道连接到补料站，通过补料站阀门的控制实现对1个及1个以上的发酵罐灵活连续补料的功能。
以上所述仅为本发明的一般实例而已，并非用来限定本发明实施的范围。故但凡依本发明的权利要求和说明书所做的变化或修饰，皆应属于本发明专利涵盖的范围之内。
