, , , , 高密度集约化水产养殖，使水体中残饵、养殖动物排泄物、微生物及其代谢产物的滞留和沉积时间过长，导致养殖水体富营养化和有害污染物(如：氨氮和亚硝氮等)积累[1~3]，严重制约着水产养殖业的发展[4, 5]。因此，如何尽快去除养殖水体中的这些有害物质，恢复水体微生态平衡，是解决制约水产养殖健康发展的关键问题之一[6]。目前，微生物修复技术已被广泛应用于水产养殖业，在养殖水体的净化和养殖动物疾病控制等方面发挥着重要的作用，但养殖水体环境甚为复杂，水体中沉降的残饵、土著微生物及其代谢产物、盐度等因素势必影响微生物制剂功效，因此，在这种复杂的水体环境中评价微生物净化水体的功效，对微生物制剂的开发和合理使用具有重要的指导意义。
硝化细菌、酵母菌(Saccharomyces)、反硝化细菌、不产氧光合细菌、乳酸菌(Lactobacillaceae)、蛭弧菌(Bdellovibrio)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)等为菌种(株)的单一或复合制剂，但这些菌种基本上来自陆源或淡水环境。在海水养殖中，现阶段主要使用这些来自于陆源或淡水菌种(如：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudanonas palustris)、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)等)的微生态制剂，除极少数菌种(株)外，如地衣芽胞杆菌X3914，在2.69%盐度条件下对饲料具有降解作用，降解率为35.2%[7]。对绝大多数菌种(株)在海水养殖水体中的适应性和脱氮功效进行系统评估的文献报道尚未见到。有针对性地开发源于海洋的微生物菌种(株)的微生态制剂将是净化养殖水体有效的策略，目前来源于海洋环境微生态水质修复剂的菌种(株)很少，如周鲜娇等[8]在海泥海水中分离到一株酵母菌，张家顺等[9]在对虾养殖池中分离到一株海单胞菌(Marinomonas) O-11等。尽管这两株菌具有良好的耐盐能力和脱氮能力，但目前仍局限于实验室研究阶段，在市场上也未见到专门用于海水养殖的微生态水质修复剂。杨素萍等[10]于福建泉州洛阳桥红树林环境中分离获得一株耐盐的不产氧光合细菌(APB)，被鉴定为海洋着色菌(Marichromatium gracile) YL28，纯培养体系研究表明：该菌株能以亚硝氮为唯一氮源或在高浓度的无机三态氮共存体系中良好生长，是迄今研究发现的对亚硝氮去除能力最高、并可同时去除高浓度无机三态氮的最具潜力的APB菌株之一[3]，并研究了有机碳化物和有机氮源对YL28去除无机三态氮的影响[11]，静息细胞对无机三态氮的脱除能力[12]，以及亚硝酸盐对该菌株生长、无机氮去除和光合色素合成的影响[13]。但该YL28制剂用于水产养殖中是否具有良好的脱氮作用，还有待于进一步研究。这是由于实际养殖水体中，常常有大量的残饵及养殖动物排泄物沉积、大量的优势土著微生物及其代谢产物，这些复杂的因子对微生态水质修复制剂功效的影响不容忽视。
本研究从厦门市集美区东南海岸线养殖散养区取海水和沉积物样品，进一步添加鳗鱼饵料提取物、氨氮和亚硝氮等，构筑污染的实际养殖水体体系，研究YL28对这种污染水体中氨氮和亚硝氮的去除效应和对总氮、COD及pH的影响，以及对沉积物总氮、COD和氮、碳代谢过程中主要酶类的作用，为YL28制剂的实际应用奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株海洋着色菌(Marichromatium gracile) YL28，自福建泉州洛阳桥红树林潮间带泥水样中分离、鉴定[10]并保存，该菌株16S rRNA基因GenBank登录号为JF719917。
1.1.2 主要仪器和试剂A390紫外可见分光光度计，购自翱艺仪器(上海)有限公司; PHS-3C酸度计，购自佑科仪器仪表(上海)有限公司; AR823分体式照度计，购自坚友(上海)测量仪器有限公司; 光照恒温培养室(温度25~30 ℃、光照强度1 000.0~4 000.0 Lux)。氯化铵、亚硝酸钠、硝酸钾，均为国产优级纯; 海藻寡糖，酶法降解龙须菜琼胶制备，单糖聚合度主要为2、3、4和6，纯度达95%以上，由国家海洋局第三海洋研究所提供。鳗鱼饵料(蛋白质含量≥38%，购自广东恒兴饲料实业股份有限公司)。三苯基甲臢，纯度大于92.0%，购自东京化成工业有限股份公司。其它化学试剂，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 培养基和菌制剂的制备培养基：在Pfennig(1988年)培养基的基础上[14]，添加24.3 mmol/L无水乙酸钠，1.0%酵母浸出粉、2.0%海藻寡糖和3.0%氯化钠，以0.75 mmol/L五水合硫代硫酸钠取代1.5 mmol/L九水合硫化钠，调整pH约7.0。菌剂制备：将培养基分装到规格为1 000 mL蓝盖瓶中，接种量为2%，用无菌培养基充满蓝盖瓶，置于光照恒温培养室中(28±1)℃培养4 d，取培养液在4 500 g条件下离心10 min，取菌体细胞，用无菌2.0%氯化钠溶液洗涤菌体3次，制备成OD660 nm约为2.0的菌种悬液作为YL28菌剂。
1.3 体系设置和处理1.3.1 海水养殖水体沉积物和海水样品的采集取样点处于厦门市集美区东南海岸线养殖散养区，地理位置处于24°34′48.9″~24°35′56.5″N，118°06′54.1″~118°07′39.3″E，海岸线长约2.5 km，采样点与海岸最大距离约90 m，退潮时，选取3个采样点采样，样点间距不小于600 m，采集深度约为4 cm。
1.3.2 海水养殖氮污染水体体系构筑和污染处理海水养殖水体由沉积物和上覆水(指沉积物上部水体)两部分构成。去除沉积物样品中的小石子等颗粒物，海水样品经8层纱布过滤，将3个采样点的沉积物和海水样品分别等量混合，充分搅拌混匀。在海水样品中添加NH4Cl、NaNO2、KNO3和鳗鱼饲料海水浸提物(煮沸30 min，静置过滤)，经测定，氨氮、亚硝氮和硝氮终浓度分别为8.37、3.18和3.88 mg/L，鳗鱼粉浓度为0.58 g/L，将之称为“污染海水”。取6个长宽高分别为20 cm、30 cm和21 cm的方形玻璃缸，分为实验组和对照组，每组3个，间隔排列。将沉积物和污染海水置于方形玻璃缸中，每缸沉积物样品为800.0 g，海水样品10.0 L，搅拌混匀，在(28±1) ℃恒温条件下静置70 h，海水与沉积物分层清晰，沉积物层厚度约2 cm，上覆水层约17 cm。实验组添加YL28菌剂，对照组添加相同体积的浓度为3.0%的盐水，添加OD660 nm约为2.0的菌剂100 mL，添加量约为1.0%，处理温度为(28±1) ℃，光照/黑暗12 h交替进行，培养体系液面光照强度为(500.0±14.0) Lux。处理过程中测定每缸上覆水的pH，取水样离心取上清，测定氨氮、硝氮、亚硝氮、总氮和COD，取沉积物离心取沉淀，测定总氮、COD和酶活性。
1.4 海水养殖水体氮污染去除效应的分析通过对水体中氨氮、硝氮、亚硝氮、总氮、COD、pH以及沉积物中总氮、COD、转化酶、蛋白酶、脲酶和脱氢酶活性的测定，分析YL28对海水养殖水体氮污染的去除效应。
氨氮、硝氮和亚硝氮分别采用次溴酸钠氧化法(GB12763.4-91)、紫外分光光度法(HJ/T3462007)和N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法(GB13580.7-92)进行测定。总氮和COD分别采用过硫酸钾氧化-紫外分光光度法和高锰酸盐指数法进行测定[15]。依据公式r(%)＝Ct/C0×100%计算各个测定指标的残留率(r)，式中C0和Ct分别表示初始值和取样时测定值。采用比色法测定转化酶、蛋白酶、脲酶和脱氢酶活性[16]，用“相对酶活”表示酶的活性变化，即各测定时刻的酶活与初始酶活的比值。pH测定：使用pH计测定。
显著性分析：使用SPSS 16.0软件中单因素方差分析(One-way ANOVA)对测定的数据进行分析，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析2.1 海水养殖水体上覆水氮污染去除效应的分析YL28对海水养殖水体上覆水氮污染去除效应如图 1所示。已有研究表明，高浓度氨氮和亚硝氮对水产养殖动物有害，硝氮对水体动物无害，总氮和COD是水体污染的主要指标，pH是水体微生物对有机物和无机物代谢总体的反映。随着处理时间延长，由于水体中存在大量土著微生物，对照组上覆水氨氮、亚硝氮明显降低。第3天时硝氮明显升高(P < 0.05)并基本稳定，总氮也呈降低趋势，但不明显(P>0.05)。第5天时COD明显降低(P < 0.05)，pH逐渐上升，至第7天时pH达到最大值(7.65)，仍在养殖水体正常范围内。处理结束(第10天)时，氨氮、亚硝氮、硝氮氮、总氮和COD残留率分别是29.88%、78.03%、126.52%、84.54%和82.06%。由此可见，养殖水体具有自净作用，土著微生物可明显去除水体中的氨氮、亚硝氮，积累硝氮、对有机氮化物和碳化物也有一定的降解作用。与对照组相应处理时间相比，实验组自处理第1天开始氨氮和亚硝氮就明显降低(P < 0.05);自处理第3天时硝氮积累量明显降低，第6天时其积累量显著低于起始值(P < 0.05);总氮和pH没有呈现显著差异(P>0.05)，但pH值变化基本上低于对照组; 处理5天内，COD去除没有呈现显著差异，但第6天开始去除率明显降低(P < 0.05)。处理结束(第10天)时，氨氮、亚硝氮、硝氮、总氮和COD残留率分别达到0.85%、7.89%、56.33%、81.99%和89.65%，与相应的对照相比，其残留率分别降低了29.03%、70.14%、70.14%、70.19%、2.55%和-7.59%。由此可见，将YL28添加到含沉积物的海水养殖水体中，与水体土著微生物相互作用，可明显降低上覆水中的氨氮、硝氮和亚硝氮，不影响水体pH，但对总氮和COD去除没有明显的改善。
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图 1 YL28对海水养殖水体上覆水氮污染去除效应Figure 1 Effects of YL28 on nitrogen removal in the overlying of mariculture water注：CK为对照组，YL28为实验组; *为显著性水平0.05Note: CK means control group, YL28 means treatment group; *means significance level 0.05 |
YL28对海水养殖水体沉积物氮污染去除效应如图 2所示。随着处理时间延长，对照组总氮和COD残留率逐渐降低，总氮残留率降低的速率更为缓慢，处理结束(第10天)时，总氮和COD残留率分别为82.99%和54.18%，如图 2A、2B。与对照组相比，实验组总氮和COD残留率明显降低，在处理第2天和第6天后，其残留率均呈现显著差异(P < 0.05)，如图 2a、2b。结果表明：海水养殖水体本身就具有自净能力，其中的土著微生物可逐渐降解沉积物中的有机氮化物和有机碳化物，使总氮和COD含量降低。YL28添加到系统中，进一步提高了总氮和COD去除率。
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图 2 YL28对水体沉积物污染物的去除和酶活性的影响Figure 2 Effects of YL28 on the pollutant removal and enzyme activity in sediment of mariculture water注：CK为对照组，YL28为实验组; *为显著性水平0.05Note: CK means control group, YL28 means treatment group; means significance level 0.05 |
水体中的物质代谢转化与微生物产生的代谢酶息息相关，为了总体上了解水体中微生物的代谢和活动情况，进一步选择4类酶并测定了它们的变化规律。其中蛋白酶主要作用于肽键，将蛋白分解为小分子肽段或氨基酸; 而脲酶可催化尿素、小分子多肽或氨基酸等脱氨，是联系有机氮化物和无机氮化物相互转化的关键反应步骤; 转化酶将寡糖(如蔗糖等)水解为单糖，与含碳有机物降解有关; 脱氢酶涉及微生物氧化还原代谢，与微生物活性有关。这4种酶活变化规律如图 2c~2f。随着时间的延长，对照体系中转化酶和脲酶活性呈现先升高，后降低的趋势，分别在第5天和第4天时达到最高，蛋白酶活性基本呈上升的规律，而脱氢酶呈现逐渐降低的趋势。实验组中转化酶、脲酶和蛋白酶活性与对照组呈现相似的变化规律，但与对照组相比，转化酶和蛋白酶分别在第4~7天、第4~10天期间，活性显著性升高，脲酶在第2~6天内其活性呈显著性差异(P < 0.05)，且前4天脲酶的活性显著升高并在第4天到达最大值，后4天显著降低。脱氢酶在前3天内呈现先升高，然后逐渐降低的变化趋势，最终和对照组相比无明显差异。由此推测：测定系统中添加YL28菌株，菌体数量升高，脱氢酶活升高，进一步与土著微生物共同作用，调节微生物产生的转化酶升高，以利用寡糖转化为微生物更容易代谢的单糖，单糖进一步被微生物代谢转化成CO2和H2O或释放于水体中，使沉积物COD降低; 调节微生物产生更高的蛋白酶和脲酶，有利于大分子蛋白质降解成小分子氮化物并脱氨形成氨氮，小分子氮化物和氨氮进一步被微生物转化或释放到水体，使沉积物中总氮量降低。处理前期，与实验组比较，虽然对照体系脲酶活力较高，但由于蛋白酶等大分子降解酶较少，不能充分的将大分子含氮化合物降解成小分子氮化物，故即使脲酶活力高，也不能体现出高的总氮去除能力。
3 讨论养殖水体中积累的氨氮和亚硝氮具有毒性，直接对养殖动物健康造成危害[17]，人们一般认为硝氮是无毒的，但高浓度硝氮在水体微生物作用下也可转化为氨氮或亚硝氮，从而对水产养殖业产生严重危害。因此，养殖水体中无机三态氮尤其是氨氮和亚硝氮的去除受到人们普遍关注。市场上用于微生态水体修复制剂的菌种(株)多种多样，不同的菌种(株)，具有不同的特点，例如：芽胞杆菌(Bacillus)货架期长、生长快、能产生多种多样的代谢酶，能够快速地代谢去除氨和降解有机物，但由于其是好氧菌，故当环境适宜时，水体中将有大量芽胞杆菌生长繁殖; 不产氧光合细菌代谢方式灵活多样，它能够利用小分子有机物、硫化物以及氨合成自身生长代谢所需营养物质，甚至具有良好的反硝化作用，从而有效去除养殖水体中氨氮、亚硝氮、硝氮和硫化氢等有害物质[17, 18]，但其降解有机大分子能力较弱，不产氧光合细菌还具有一个良好的特点是耗氧量较小，不与养殖动物争氧，因而，也是微生态水质修复剂常见菌种。近年来，用于养殖水体脱氮微生物菌株仍在不断选育，如蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus) YB3[19]、沼泽红假单胞菌R-3[20]、海单胞菌O-11[9]以及枯草芽胞杆菌和腐殖酸复配制剂[21]等。选育的菌株也主要集中在淡水或陆源种，却很少针对性地选育适合于海水养殖的微生态水体修复剂的菌种[22, 23]。目前菌种(株)选育和评价常采用人工添加污染物的纯培养体系，也有以灭菌的实际养殖水体作研究体系，常以氨氮、亚硝氮或鱼饲(饵)料作为单一或几种添加污染物，添加量分别一般在3~10 mg/L、0.2~4.0 mg/L和0.5%~1.0%范围内[7]。为了能快速地观察到去除污染物的效果，添加微生态制剂用量常常在1%~10%范围内[19]。这种体系与实际养殖水体差异很大，差异最大的是实际水体中拥有大量土著微生物、复杂多样的有机物和污染物。如果将纯培养体系选育和评价的菌株直接用于水产养殖区域试验或大田试验，风险性较大、成本较高，而且不同养殖区域的变异性也很大，难以控制，甚至给生产带来损失。因此，我们建议在进行水产养殖区域试验或大田试验前，首先应该进行实际水体实验室规模的试验。本研究的特色是在实验室水平上，构建了含有沉积物、氮和有机物污染的海水养殖系统，并利用该系统评价了一株高耐盐菌株YL28对体系中氮和有机物的去除作用。体系中污染物含量选择在目前纯培养体系用量的范围内，氨氮、硝氮、亚硝氮和鳗鱼饲料含量分别约为8 mg/L、3 mg/L、3 mg/L和0.6%水平。为了快速观察到评价效果，选择制剂用量为1%，也在目前效果评价的用量的范围内。为了避免制剂培养基组分对体系的干扰，收集制剂细胞并用2%氯化钠洗涤细胞，配制成OD660 nm约为2.0的细胞悬液。
研究表明：养殖池沉积物-水界面是微生物代谢转化有机物的重要区域，对维持养殖水体的稳定具有重要的调控作用[24, 25]。在这一界面区域，有机物不断沉降，优势菌群快速增长代谢，由于溶氧不足，微生态失衡，不能将有机物彻底降解，有机小分子化合物以及氨氮、硝氮和亚硝氮等无机氮不断积累并向水体释放[11, 25]，造成水体氨氮和亚硝氮等污染物的积累。那么就要求，在这种污染环境中添加的微生态制剂对氨氮和亚硝氮等污染物去除量大于水体产生污染物的量，最好还能对水体和沉积物的其它水体指标也具有改善作用。因此，本研究将YL28制剂添加在含有沉积物、氮和有机物污染的海水养殖系统中，不但测试了YL28对水体污染指标的变化，还测试了沉积物总氮、COD和4种酶活的变化规律。结果表明，水体本身具有一定的自净能力，随时间延长，水体氨氮、亚硝氮、水体和沉积物总氮、COD含量均降低，水体硝氮明显积累。YL28能够明显提高水体氨氮、亚硝氮、沉积物总氮和COD的去除率，降低了水体硝氮的积累率，甚至对硝氮也具有一定的去除作用，但水体总氮和COD含量去除没有进一步提高，与对照没有显著差异。与对照相比，这处理期间不同时间范围内蛋白酶、脲酶、转化酶和脱氢酶这4种酶活均有明显的提高，但酶活的变化规律基本与对照一致。
一般认为，水体氨氮的去除方式主要是亚硝化和硝化方式转化为亚硝酸盐和硝酸盐，同时还有氨同化方式，亚硝酸盐和硝酸盐主要通过反硝化作用矿化为氮气。本课题组前期研究表明，YL28在以无机三态氮为唯一添加氮源的纯培养系统中，能良好地脱氮[3]，而且在无机三态氮共存时也能良好地进行脱氮[26]。在本研究的含沉积物的体系中，YL28也表现出了良好的无机三态氮去除能力。本研究为进一步大田水产养殖水体修复研究奠定了基础。
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