田云龙 蒋细良。姬军红 朱昌雄
摘要 ：目的 针对目前没有适合中生菌素产生菌的合成培养基的现状，进行中生菌素产生菌发酵合成培养基的设计，并对其进行优化，以期为以后中生菌素产生菌发酵生产、营养生长、代谢、遗传育种和产素机制的研究提供基础。方法 顺序通过无机氮源和有机氮源的筛选、正交试验，并利用统计学软件SPSS V13.0对实验数据进行分析，确定并优化中生菌素产生菌发酵合成培养基的组成成分。结果 最终确定了中生菌素产生菌发酵合成培养基，该培养基在定量加入微量元素的基础上，组成成分为谷氨酸钠0.5％，葡萄糖1.5％，可溶性淀粉1.5％，NHvalue="4" unitname="C">4C1 0.3％，KH2PO4 0.02％，MgSO40.025％，NaC10.5％，CaCO3 0.3％。结论 经过发酵验证，该培养基的产素能力可达2000μg／mL左右，虽然比天然成分培养基低，但可以满足以后营养生长、代谢、遗传育种和产素机制等的研究。
关键词： 中生菌素；合成培养基；设计；优化
中生菌素是新型的农用抗生素，它对革兰阳性菌、革兰阴性菌、丝状真菌都有强烈的抑制或杀伤作用，对水稻白叶枯病、白菜软腐病、苹果轮纹病及苹果叶斑病等有良好的防效。目前，中生菌素已在全国部分省市应用推广，并取得了较大的经济效益。
一直以来，中生菌素研究及发酵生产所用的培养基均为天然培养基(其中含有豆饼粉、玉米粉)，该类培养基的成分复杂，碳源和氮源丰富，使用这种富营养型培养基进行发酵，效价较高，目前摇瓶效价可达5000μg／mL。但由于其中的豆饼粉和玉米粉成分复杂，不同产地、不同批次存在差异，影响了对实验结果进行定量和定性分析，合成培养基则可以弥补这个缺点。通过对合成培养组分的研究，确定影响发酵的主要因子，有利于优化发酵培养基，推动实际生产，也利于对发酵代谢机制的研究。
以不同的化学成分已知的氮源代替原培养基中的天然氮源，进行中生菌素合成培养基成分的筛选优化，比较发酵结果，选定合成培养基中所要采用的合成氮源；然后进行正交实验，利用统计学软件SPSS Version 13.0对实验数据进行分析，最终确定了中生菌素产生菌的合成培养基的组成成分，为以后研究中生菌素产素菌营养生长、代谢、遗传育种和产素机制提供了有力工具。
1 材料与方法
1.1 菌种
发酵所用菌种为淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var．hainanensisn ) UV -69突变株，由中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所保存。
1.2 培养基
淀粉培养基：可溶性淀粉value="10" unitname="g">10g、KH2PO4 value="1" unitname="g">1g、MgSO4 value=".5" unitname="g">0.5 g、NaNO3 value="2" unitname="g">2g、KC1 value=".5" unitname="g">0.5g，FeSO4 value=".01" unitname="g">0.01g，琼脂lvalue="5.2" unitname="g">5.20g，用1000mL开水顺序加入，自然pH值。
微量元素：每1000mL合成培养基中加入0.017mg(NH4) 6Mo7O24•4 H2O，0.026mg H3BO3， 0.18mg CuSO4•7H2O， 4mg ZnSO4•7H2O，1mg FeSO4， 10 mg MnCl2•4H2O 。
1.3 培养方法
斜面菌种的培养：用接种环从保存的斜面菌种中刮取淡紫灰链霉菌海南变种的孢子，转接到新鲜的淀粉斜面培养基中，培养箱中，value="28" unitname="℃">28℃培养5—7d。
茄子瓶种子的培养：用接种环从试管斜面菌种中刮取菌种，转接到新鲜的茄子瓶淀粉培养基中，培养箱中，value="28" unitname="℃">28℃培养5-7d 。
摇瓶发酵：从培养好的茄子瓶菌种斜面中挖取小菌块转移到摇瓶中，然后在200r／min，value="29" unitname="℃">29℃条件下培养64h 。
1.4 效价测定
采用管碟法测定生物效价，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为指示菌。
1.5 合成培养基的筛选优化方法
采用正交实验法对合成培养基的组成进行优化。试验采用L27 (313) 正交表，表头设计及因素水平设置见表1和表2 。整个试验共27个处理，每个处理设置2个重复。
表1 正交实验表头设计
Tab．1 Design of orthogonal test by L27 (313 ) matrix
|
列号
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
9
|
10
|
11
|
12
|
13
|
|
因素
|
A
|
B
|
A×B
|
|
E
|
A×E
|
|
B×E
|
C
|
D
|
|
|
B×D
|
表2 正交实验因素及水平
Ta b．2 Factors and levels assigned in the L27 (313 )orthogonal matrix
|
水平
|
因素
|
|
谷氨酸钠（A）
|
葡萄糖（B）
|
淀粉（C）
|
NH4Cl（D）
|
KH2PO4（E）
|
|
1
|
0.5%
|
0.5%
|
0.5%
|
0.3%
|
0.02%
|
|
2
|
1.5%
|
1.5%
|
1.0%
|
0.6%
|
0.06%
|
|
3
|
2.5%
|
2.5%
|
1.5%
|
0.9%
|
0.1%
|
1.6 数据的统计处理
使用SPSS13.0软件对实验数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 合成培养基中氮源的筛选
选取谷氨酸钠、脲、NH4Cl作为氮源，再加以不同组合，各设置4次重复分别进行发酵，结果见表3。 从表3可以看出，谷氨酸钠与NHvalue="4" unitname="C">4C1 组合作为氮源发酵效价较高，分别比其它几种氮源高38.78％，30.77％，54.55％，67.49％，9.67％，因此选定其作为合成培养基的氮源。
表3 氮源筛选实验结果
|
氮源
|
谷氨酸钠+氯化钠
|
氯化铵
|
脲+氯化铵
|
氯化铵+硝酸钠
|
脲
|
谷氨酸钠
|
|
效价（μg/ml）
|
1700±58
|
1225±93
|
1300±158
|
1100±32
|
1015±125
|
1550±24
|
表4 正交试验结果
|
行号
|
列号
|
效价（μg/ml）
|
|
1（A）
|
2（B）
|
5（E）
|
9（C）
|
10（D）
|
Ⅰ
|
Ⅱ
|
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
1
|
683.78
|
800.00
|
|
2
|
1
|
1
|
2
|
2
|
2
|
166.50
|
267.98
|
|
3
|
1
|
1
|
3
|
3
|
3
|
400.00
|
180.00
|
|
4
|
1
|
2
|
1
|
2
|
2
|
2150.00
|
1950.00
|
|
5
|
1
|
2
|
2
|
3
|
3
|
1603.90
|
1326.95
|
|
6
|
1
|
2
|
3
|
1
|
1
|
487.50
|
412.50
|
|
7
|
1
|
3
|
1
|
3
|
3
|
800.00
|
900.00
|
|
8
|
1
|
3
|
2
|
1
|
1
|
612.50
|
725.00
|
|
9
|
1
|
3
|
3
|
2
|
2
|
270.00
|
190.50
|
|
10
|
2
|
1
|
1
|
2
|
3
|
235.00
|
240.00
|
|
11
|
2
|
1
|
2
|
3
|
1
|
1000.00
|
962.50
|
|
12
|
2
|
1
|
3
|
1
|
2
|
525.00
|
525.00
|
|
13
|
2
|
2
|
1
|
3
|
1
|
1950.00
|
2100.00
|
|
14
|
2
|
2
|
2
|
1
|
2
|
485.00
|
500.00
|
|
15
|
2
|
2
|
3
|
2
|
3
|
217.45
|
261.49
|
|
16
|
2
|
3
|
1
|
1
|
2
|
612.50
|
537.50
|
|
17
|
2
|
3
|
2
|
2
|
3
|
227.24
|
185.00
|
|
18
|
2
|
3
|
3
|
3
|
1
|
437.50
|
691.56
|
|
19
|
3
|
1
|
1
|
3
|
2
|
175.00
|
210.00
|
|
20
|
3
|
1
|
2
|
3
|
3
|
17.30
|
28.50
|
|
21
|
3
|
1
|
3
|
1
|
1
|
130.00
|
165.00
|
|
22
|
3
|
2
|
1
|
2
|
3
|
138.09
|
100.09
|
|
23
|
3
|
2
|
2
|
1
|
1
|
1125.00
|
653.20
|
|
24
|
3
|
2
|
3
|
2
|
2
|
216.76
|
94.29
|
|
25
|
3
|
3
|
1
|
2
|
1
|
1411.62
|
886.54
|
|
26
|
3
|
3
|
2
|
3
|
2
|
453.78
|
337.50
|
|
27
|
3
|
3
|
3
|
1
|
3
|
253.50
|
134.28
|
2.2 合成培养基的筛选
利用正交实验方法5 种主要营养成分谷氨酸钠(A)、葡萄糖(B)、淀粉(C)、NH4Cl (D)、KH2PO4 (E) 进行优化，实验结果见表4。
利用SPSS Version 13.0 统计软件对正交试验结果进行方差分析和多重比较。分析结果见表5 和表6 。
表5 方差分析表
|
变异源
|
离差平方和
|
自由度
|
均方
|
F
|
P
|
|
校正后的模型
|
14146892.159（a）
|
24
|
589453.84
|
10.43
|
1.04×10-4
|
|
截距
|
19141514.631
|
1
|
19141514.63
|
338.77
|
1.53×10-17
|
|
谷氨酸钠
|
1599115.305
|
2
|
7999557.65
|
14.15
|
5.15×10-5
|
|
葡萄糖
|
2372350.384
|
2
|
1186175.19
|
20.99
|
2.31×10-6
|
|
KH2PO4
|
3940087.961
|
2
|
1470043.98
|
26.02
|
3.38×10-7
|
|
可溶性淀粉
|
1089156.428
|
2
|
544578.21
|
9.64
|
0.001
|
|
NH4CL
|
1863079.188
|
2
|
931539.59
|
16.49
|
1.65×10-5
|
|
谷氨酸钠×葡萄糖
|
1756978.011
|
4
|
439244.50
|
7.77
|
2.19×10-4
|
|
谷氨酸钠×KH2PO4
|
557862.296
|
2
|
278931.15
|
4.94
|
0.014
|
|
葡萄糖×KH2PO4
|
1825404.796
|
4
|
456351.20
|
8.08
|
1.67×10-4
|
|
葡萄糖×NH4Cl
|
72161.625
|
2
|
36080.81
|
0.64
|
0.535
|
|
误差
|
1638573.356
|
29
|
56502.53
|
|
|
|
总和
|
34926980.146
|
54
|
|
|
|
|
校正后的总和
|
15785465.515
|
53
|
|
|
|
R2=0.896(调整R2=0.810)
由表5可知，校正后的总体模型在α=0.01的水平上F检验达到了极显著，总体模型拟合得很好，因此可进一步对各个因素进行方差分析，确定各个因素对效价影响作用的大小。由方差分析表可知，5个因素对中生菌素的发酵效价都有极显著影响，其影响次序依次为KH2PO4 >葡萄糖>氯化铵>谷氨酸钠>可溶性淀粉。4对互作效应中，除葡萄糖与NHvalue="4" unitname="C">4C1的互作对发酵效价无显著影响之外，其它3对互作都有显著影响，其次序依次为葡萄糖×KH2PO4>谷氨酸钠×葡萄糖>谷氨酸钠×KH2PO4。
对表6进行分析并结合多重比较的结果(在此没表3氮源筛选实验结果有列出)可知，5个因素的最佳组合为：谷氨酸钠选择水平l，葡萄糖选择水平2，KH2PO4选择水平1，NHvalue="4" unitname="C">4C1选择水平l，可溶性淀粉选择水平3 ，即合成培养基配方为谷氨酸钠0.5％，葡萄糖1.5％，可溶性淀粉1.5％，NHvalue="4" unitname="C">4C1 0.3％，KH2PO4 0.02 ％，Mg SO4 0.025％， NaCl 0.5％，CaCO3 0.3％，再加入微量元素。
2.3合成培养基中中生菌素产生菌发酵效价
为验证筛选得到的合成培养基发酵产中生菌素的能力，对正交试验中发酵效价较高的处理、筛选得到的培养基进行发酵对比，结果如表7 。
表7 合成培养基验证试验结果
|
不同培养基
|
4
|
5
|
7
|
13
|
23
|
25
|
合成培养基
|
|
发酵效价（μg/mL）
|
1356.46±367.45
|
688.33±86.07
|
791.67±260.21
|
1200.00±482.18
|
880.62±195.39
|
1311.67±45.37
|
2194.00±252.04
|
由表7可看出，优化得到的合成培养基的产素能力明显高于正交试验中发酵效价较高的6个处理，分别比4、13和25号处理高38.17％、45.31％和40.22％，可用于进一步的中生菌素产生菌生理生化特性研究。
3 讨论
进行正交试验时，处理4和13的发酵效价均达2000单位，而在验证试验时却只有1200个单位左右，2次实验间的重复性不好。这可能是由于摇瓶实验的影响因素众多，每批实验条件都不可能做到完全一致。如：一批配制的培养基，而且在同一摇床、同一恒温间培养，等到放瓶时结果就有差别，而批次之间的差异更难控制。因此，在实验过程中，就需要严格控制实验条件。比如，培养基必须是同一批配制的；接种量保持均匀一致，将种子液尽量混匀后再接种；种子液的年龄和浊度要保持批次之间的一致性等。
目前，在中生菌素产生菌分类鉴定、有效成分鉴别、抗菌活性、毒理测定、作用机制、发酵生产、剂型创制、田间推广应用等方面取得了很大进步，但有关中生菌素生物合成过程中该菌的产素机制、生理学及遗传学研究尚少，在这些领域研究进展缓慢的原因之一就是使用天然培养基，其中成分的复杂性妨碍了对实验结果的正确分析和判断。本文开发出的合成培养基的发酵效价虽然与天然成分培养基有较大差距，但是合成培养基容易控制已知成分，确保了对实验结果进行比较准确和可靠地分析，在中生菌素的生产和理论研究中都具有一定意义，可以弥补天然成分培养基成分易变，实验结果分析困难的缺点。
参考文献 ：略
