1 培养方式
在大规模工业化生产中,基因工程重组大肠杆菌高密度发酵培养方式主要有补料分批培养和透析培养等,其中补料分批培养方式应用最多。
1.1 补料分批培养
补料分批培养是一种介于分批培养和连续培养之间的培养方法,是目前应用最广泛、最成熟的培养技术,它是一种在发酵过程中间歇或连续补加新鲜培养基,从而使菌体不断生长的培养方法。补料分批培养可以为菌体持续供给生长所需的营养物质,能够延长生长对数期,从而使菌体浓度保持在较高水平。另外,不断补料可对培养基进行一定程度的稀释,从而稀释有毒代谢产物,减少代谢产物对生长的抑制,有效降低遗传不稳定性,对培养过程起到一定的控制作用。HUSY等利用补料分批培养技术得到的重组大肠杆菌菌体浓度为183g/L（DCW）。Lee等在发酵中采用限制葡萄糖供应并耦合中空纤维过滤器进行细胞循环,大肠杆菌密度达到145g/L,重组青霉素酰化酶生产率为分批发酵的10倍以上。分批补料培养的另一优势是只需进一步改进发酵工艺就可投入大规模工业化生产,因此特别适用于各种工程菌的高密度培养,也是现今被研究和应用最多的培养方式。分批补料培养的补料方法分为非反馈补料和反馈补料两种。
1.1.1 非反馈补料
非反馈补料主要有恒速补料、变速补料、指数补料等类型。恒速补料是将限制性基质的碳源以恒定的速率流加入。随着发酵的进行,对于培养液中的菌体来说,营养物质浓度是逐渐降低的,菌体的比生长速率也逐渐减小,但菌体能够持续生长,培养液中的菌体量在培养过程中线性增加。恒速补料虽简单易行但补料目的性较差,无法控制菌体的比生长速率。变速补料是指在培养过程中,营养物质的补加速率以阶段性或线性等方式不断加快或减慢。当菌体浓度较高或菌体生长旺盛时,就加快补料速度,加入更多营养物促进细胞的生长繁殖从而实现高密度；反之,就减慢补料速度。变速补料速率需根据细胞生长情况不断调节补料速率,但操作灵活性差。指数流加补料法是根据指数生长期内菌体数目呈指数增加的特点,同时指数流加营养物质,从而保证菌体以恒定的比生长速率生长。指数补料是一种简单、有效的补料方式,它能使营养物的浓度控制在较低水平,有效减少乙酸等有害代谢物的积累,使菌体密度以一定的比生长速率呈指数形式增加（比生长速率通常维持在0.1-0.35/h之间）。Korz等采用指数补料方式,以葡萄糖和甘油为碳源培养重组大肠杆菌,菌体密度分别达到了128g/L及148g/L。孙艳等采用分阶段控制比生长速率的指数补料策略培养E.coli JM109,有效缓解了单一比生长速率情况下溶氧不能无限制增加的问题,控制培养液中乙酸浓度在2.53g/L左右,细胞密度（OD600）达到91.2。李寅等对重组大肠杆菌进行了指数流加培养, 培养25h 后细胞干重与重组谷胱甘肽蛋白总量分别达到80g/L和880mg/L,比摇瓶结果分别提高8.3和4.6倍。同时有研究者发现, 采用指数流加补料法可获得较高的细胞得率, 但外源蛋白产量并不会明显提高。这可能是由于指数流加补料法是根据微生物指数生长理论而发展起来的方法,所以其对微生物生长的促进作用要大于对外源蛋白表达的促进作用。
1.1.2 反馈补料法
由于非反馈补料法的补料程序是预先设定的,若微生物的生长方式与预想不同,非反馈补料法无法对其进行有效的调节,易导致乙酸生成。反馈补料法是指菌体代谢时产生的某种特殊物质(如乙酸, 二氧化碳等)会使发酵中的某些参数发生变化,依据这些参数的变化判断菌体代谢状况,再进行补料的方法。由于反馈补料法能够根据反馈的信息及时调整补料速率和策略,从而有效控制营养物质浓度,因此被广泛应用于工程菌的高密度培养。
根据反馈指标的不同,反馈补料法又可分为恒pH值补料法、恒溶解氧补料法、CER（CO2排放率）法等。常用的是恒pH 值补料法和恒溶解氧补料法。
恒pH值补料法是当营养物资充足时,菌体产酸和二氧化碳，导致培养液pH下降；当营养不足时菌体利用大量氮源产生碱性物质,导致pH值上升。因而可以把pH值的变化作为需要补料的标志,通过补充合适的补料培养基,维持培养液pH值。Jeong等采用恒pH值法反馈补料方式培养大肠杆菌,菌体密度（OD600）达到186。Kim等采用恒pH值法反馈补料培养重组大肠杆菌产人胰高血糖素样肽,菌体密度达104.2g/L。蒙健宗等在高密度发酵重组海藻糖合成酶工程菌时,采用恒pH值法反馈流加氨水和葡萄糖,维持培养液pH值为6.8,乙酸积累被控制在6.26g/L以下,补料发酵12h后获得细胞干重为51.5g/L,是分批培养的7.5倍；蛋白表达率为15.2%,是分批培养的4.5倍。但也有学者指出,由于pH值变化不完全是葡萄糖代谢的结果,该方法容易造成补料体系的错误。
恒溶解氧补料法是当营养物质充足时,菌体生长代谢旺盛,同时消耗大量的氧,导致溶解氧下降；当营养物质不足时,菌体代谢强度下降,耗氧量也减少,溶氧上升。因此可以将溶解氧的变化作为控制补料的指标,通过补充合适的补料培养基,维持培养液溶氧值在恰当水平。颜真等采用恒溶解氧法发酵工程菌DH5α/pBV-LTLTNF时,保持培养过程中的溶解氧为30%-40%,同时限制性流加葡萄糖,发酵12h后,菌体密度（OD600）达40-50,LTLTNF浓度为5.12g/L,达菌体总蛋白的50%。但胡沛臻等利用恒溶解氧补料法时发现,由于在培养初期菌体密度低,溶氧变化不明显,使用该方法易导致补料滞后。
反馈补料可以跟反馈信息及时调整补料的速率和策略,但具有一定的滞后性,不能完全避免糖浓度波动和代谢副产物的积累；非反馈补料也存在不能根据发酵环境的变化和菌体生长的具体情况作出反馈调节的缺点,因此找到一种新的、更有效的补料方法成为研究的热点和突破点。Restaino等在培养E.coli K4产荚膜多糖时,采用在发酵前期用指数补料、在发酵后期用微孔过滤的分阶段混合补料方法,取得了较好的效果,菌体浓度达到36.4g/L,多糖产量达到4.33g/L。Biener等在培养重组E.coli TB1时,建立了以菌体生长过程中产生的热量为依据进行关联补料,从而更加准确和持续控制菌体比生长速率的培养调控模型,为大肠杆菌的高密度培养提供了新的方向。
1.2 透析培养
透析培养是利用膜的半透性,根据分子不平等扩散原理使外源蛋白和培养基分离,从而除去乙酸等小分子代谢产物,解除其对生产菌的抑制作用,并维持较适宜的营养浓度,从而获得高密度菌体。Fuchs C在大肠杆菌高密度培养中通过透析培养降低乙酸含量,使细胞密度超过190g/L,蛋白浓度是分批补料发酵的3.8倍。耿艺介对不同微生物（葡萄球菌、大肠杆菌、极端环境型微生物和乳酸杆菌）的透析培养证明,细胞浓度都比其他发酵方法提高了30倍。但透析培养以生长培养基做透析液,透析过程中大量的甘油被当做废物透析掉,生产中耗资大,目前在实验室中应用较为成功,但工业化生产还有待于进一步改善。
2 诱导方式和诱导剂
高密度发酵分为生长阶段和生产阶段,生长阶段以获得较大量的菌体为目标,而生产阶段则以诱导表达外源基因从而获得大量表达产物为目标。在高密度培养中,常使用PL, Pr或Trp诱导启动子,以更好地控制目的产物的表达,避免目的蛋白积累而过早抑制细胞的生长。
为了获得高产量的表达产物,载体构建时常常插入启动子,不同启动子需要选择不同的诱导方式。目前主要有热诱导和化学诱导（IPTG诱导）两种方式。
对于热诱导,升温过程尤为重要。温度诱导型表达系统要求升温要快,因为升高温度会诱导热激蛋白的产生,从而抑制目的蛋白的表达；持续时间要短,应在2分钟内完成,因为时间太长会导致热激蛋白含量剧增,目的蛋白相对较低,为后续纯化带来困难。诱导一定时间后,由于外源蛋白的表达、代谢副产物的累积、细菌的衰老等原因,细菌会停止生长,蛋白的合成也会停止。因此要选择适宜的时机停止发酵,避免菌体自溶和目的蛋白变性。巫爱珍等人以PL启动子控制生产干扰素a-2b, 30℃生长8h后升温至42℃诱导表达2h,表达量占细胞蛋白的20%。于瑞嵩等采用30℃-42℃-40℃发酵方法,最终菌体密度OD550值为120左右。马文峰等采用2次升温诱导的方法,最终发酵的细胞密度OD600值为150,蛋白表达量为4.8g/L。Fateneh等在42℃诱导30min后再降到37℃诱导4h,取得了很好的效果。
目前,常采用的化学诱导是乳糖基因（lac）及其衍生的启动子及其融合产物( Tac , Pac , Rac ),再加入异丙基βD硫代半乳糖苷（IPTG）诱导外源基因的表达,其用量会影响表达水平。Sriubolmas等指出IPTG浓度在0.0025-0.1mmol/L时,增加IPTG浓度可提高重组青霉素G酰化酶活性,而IPTG浓度在0.2-0.5 mmol/L时,酶活性下降。胡沛臻等构建人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌,对数生长期时用200μmol/L IPTG 诱导5h,菌体量提高至70g/L以上,目的蛋白表达量占菌体蛋白总量的38%以上。YILDIRIM S等研究表明,IPTG浓度为0.5mmol/L,是细菌生长和产物表达的最佳浓度；何勇智等采用0.5mmol/L IPTG进行诱导,发酵产量比传统的LB培养基及培养方法提高了6倍多。尽管IPTG的诱导效果令人满意,但IPTG 价格昂贵,造成生产成本增加,而且毒性对人体产生严重伤害,对发酵所得的生物产品带来不利影响,因此它在大规模发酵生产中的应用受到了限制。为了寻找ITPG的替代物,国内外学者做了大量的尝试。有人尝试用乳糖代替IPTG,并取得了不错的效果。陈亮等在用乳糖诱导重组大肠杆菌BL21表达三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD时发现,目的蛋白表达量占总蛋白量的36.62%,与IPTG的诱导结果(35.03%)无明显差别,而且收获的菌体量比用IPTG诱导时更高。WU PH等通过乳糖诱导的分批补料培养,获得的全细胞生物催化剂的生产效率比IPTG诱导的分批培养提高了6倍。卫红飞等报道,用4g/L乳糖诱导工程菌4h,得到重组蛋白表达量与0.1% IPTG 诱导工程菌3h 后相似,说明适当延长乳糖诱导时间,可以得到较高的表达量。吴一凡等在诱导重组大肠杆菌表达B淋巴细胞刺激因子时综合比较了乳糖和IPTG的诱导效果,发现用乳糖作为诱导剂时,目的产物占总蛋白量的15.7%, 略低于IPTG的诱导效果,但成本仅为用IPTG诱导时的3%。李兆鹏等发现,乳糖的诱导表达量只能达到IPTG的55%。尽管乳糖的诱导效果不及IPTG,诱导过程也比IPTG 复杂的多,但乳糖无毒、价廉,且其本身又可作为一种碳源被大肠杆菌利用,因此乳糖替代IPTG作为诱导剂的研究对工业化发酵生产重组蛋白具有重要的意义。
重组大肠杆菌高密度高表达发酵是基因工程产业化的关键,也是基因工程技术从实验室通向市场的桥梁,改进高密度发酵培养方式、优化诱导方式和诱导剂,对实现重组大肠杆菌高密度高表达发酵工业化生产具有重大意义。
