在原核蛋白表达过程中,选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素:表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。事实上,在平时的实验中,最容易被忽视的就是宿主菌的选择――多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或者是载体配套的菌株,而不去追究原因――即使表达结果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究菌株的选择是否适合。
作为原核表达的宿主,对外源基因的表达会产生一定的影响,是勿庸置疑的。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂,按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”――因为很难亲眼观察微观世界中表达是如何进行的,当出现问题时,我们需要经验判断问题所在。宿主细胞对原核表达可能会产生哪些影响呢?
知其然还要知其所以然。比如,菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21 系列就是lon 和ompT 蛋白酶缺陷型,也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因,为T7表达系统而设计。
真核细胞偏爱的密码子和原核系统有不同,因此,在用原核系统表达真核基因的时候,真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子,从而导致表达效率和表达水平很低。改造基因是比较麻烦的做法,Rosetta 2 系列就是更好的选择――这种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌,补充大肠杆菌缺乏的七种(AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA及CGG)稀有密码子对应的tRNA,提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平。(已经携带有氯霉素抗性质粒)
当要表达的蛋白质需要形成二硫键以形成正确的折叠时,可以选择K-12衍生菌Origami 2系列,thioredoxin reductase (trxB)和glutathione reductase (gor)两条主要还原途径双突变菌株,显著提高细胞质中二硫键形成几率,促进蛋白可溶性及活性表达。(卡那霉素敏感)
Rosetta-gami? 2 则是综合上述两类菌株的优点,既补充7种稀有密码子,又能够促进二硫键的形成,帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。(卡那霉素敏感)
Origami B 是衍生自lacZY突变的BL21菌株,这个突变能根据IPTG的浓度精确调节表达产物,使得表达产物量呈现IPTG浓度依赖性。(四环素敏感)
在决定试用这些名字古怪的菌株时,有几个小Tips要注意的,一个是不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性,要注意自己的表达质粒是否能与之兼容。比如Rosetta 2 已经携带有氯霉素抗性质粒,不能再用氯霉素筛选等等。
现象
可能原因
改进方案
建议菌株
无蛋白表达出现截短蛋白
E. coli 的密码子偏移性
补充稀有密码子的tRNA;将稀有密码子突变为普通大肠杆菌密码子Rosetta 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B
RosettaBlue
包涵体
二硫键形成困难
降低宿主胞质的还原性;利用促进二硫键形成的各种载体标签Origami 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B
表达过快,表达量过高
控制优化表达水平:降温,IPTG浓度优化
Tuner
Rosetta-gami B
蛋白无活性
蛋白错误折叠
降低宿主胞质的还原性;利用促进二硫键形成的各种载体标签Origami 2
Rosetta-gami 2
Rosetta-gami B
控制优化表达水平:降温,IPTG浓度优化
Tuner
Rosetta-gami B
细胞死亡,生长极困难
毒性蛋白
更严格的本底表达控制
pLysS 菌株
无克隆生长
过高本底表达
更严格的本底表达控制
pLysS、pLysE 菌株
重组质粒和菌株的保存建议
在实验室里保存重组菌株的时候,为了挑菌和传代方便,我们常用LB平板保存在4℃冰箱中,需要提质粒和表达接种的时候,就直接从平板上挑菌,但是这种方法对于重组质粒的稳定性不利,容易出现质粒丢失、表达水平不稳定、菌株退化乃至发生污染等情况。我们建议:
1、长期存放菌株和pET重组子应该存在甘油-70℃保种。但是要注意高浓度甘油(> 10%)会导致质粒不稳定。请尽量保持甘油浓度8%。(15%浓度的甘油保种液和新鲜菌液1:1就行)
2、重组质粒不宜长期保存于表达菌株(带DE3的大肠杆菌)中,请尽量使用带有recA endA 突变的克隆菌株(比如C600,DH5a)进行质粒抽提和保存质粒。表达型的菌株提质粒经常会有质量不高或者背景的问题。特别是大量抽提。
其实不仅仅是表达,建库克隆都会涉及菌株的不同要求,推荐看看以下文章:克隆/建库专用超级高效感受态细胞。感受态不是目的,菌株的背景才是关键。
