代谢工程方法改造大肠杆菌生产胸苷

 

李思梦1，李晓静2，陈涛1

投稿时间： 2014-04-01

1 天津大学化工学院教育部系统生物工程重点实验室，天津300072

2 海军工程大学勤务学院，天津300072

李思梦, 李晓静, 陈涛. 代谢工程方法改造大肠杆菌生产胸苷. 生物工程学报, 2015, 31(1): 105–114.

Li SM, Li XJ, Chen T. metabolic engineering of Escherichia coli for thymidine production. Chin J Biotech, 2015, 31(1): 105–114.
 对大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3) 生物合成胸苷进行了研究。通过敲除E. coli BL21 嘧啶回补途径的deoA、tdk 和udp 三个基因，BS03 工程菌株能够积累21.6 mg/L 胸苷。为了增加合成胸苷前体物核糖-5-磷酸和NADPH 的供给，进一步敲除pgi 和pyrL 使工程菌BS05 胸苷的产量提高到90.5 mg/L。而通过过表达胸苷合成途径的ushA、thyA、dut、ndk、nrdA 和nrdB 六个基因，菌株BS08 胸苷的产量能达到272 mg/L。通过分批补料发酵，BS08 最终可以积累1 248.8 mg/L 的胸苷。本研究结果表明经过代谢工程改造的E. coli BL21 具有良好的胸苷合成能力和应用潜力。

关键词:代谢工程，胸苷，从头合成途径 

胸苷包括一分子 2-脱氧核糖和一分子胸腺 嘧啶碱基，是抗艾滋病司他夫定 (3′-脱氧-2′,3′- 双脱氢胸苷) 和叠氮胸苷的前体物质[1-2]。由于 艾滋病病人数量的急剧增加，廉价的、能大规 模生产胸苷的工艺方法得到了广泛的关注。用 化学合成法生产胸苷，工艺过程十分冗长使得 最终得到的胸苷成本较为昂贵[3-5]。使用生物法 生产胸苷具有工艺简单、后续分离成本低廉等 优势，因此构建高产胸苷的工程菌株具有良好 的应用前景。

目前，国内 多是用菌种 诱变[6]来提 高胸苷的生产水平 或酶法 [5,7-8] 来生产胸苷 。在细胞 中，胸苷的用途仅涉及到 DNA 的合成，因此 细胞内胸苷的含量非常低，并且受到严密的调 控[9-12]。作为 DNA 的组成物质，嘧啶核苷酸 在微生物细胞内的合成有 2 种途径：一条是利 用葡萄糖等碳源和氮源合成核苷酸，这种合成 途径称为从头合成途径 (de novo pathway)，另 一条是由 嘧 啶碱基通 过 核糖基化 及 磷酸化而 合成的补救途径。补救途径是细胞摄取环境中 的碱基和核苷来合成核苷酸，在这个过程中， 需要胸苷磷酸化酶、胸苷激酶和尿苷磷酸化酶 参与催化，这 3 种酶分别由 deoA 、tdk 和 udp 基因编码[13]。从头合成途径是从氨甲酰磷酸与

天冬氨酸合成氨甲酰磷酸天冬氨酸开始，经过 一  系列反应合成 UMP 。UMP 是嘧啶核苷酸的 共同前体，它经过一系列反应生成胞嘧啶核苷 酸和胸腺 嘧 啶核苷酸 。 在野生菌 中 ，前体物 dUMP 被直接转化成 dTMP ，进而生成 dTDP 和 dTTP 。胸苷在胞内的主要存在形式是 dTTP ， 而且 dTTP 一经合成就马上被利用合成 DNA [14]。 目前通过 代 谢工程方 法 构建胸苷 生 产菌株的 研究较少，其中 Lee 课题组对大肠杆菌生产胸 苷进行了较系统的研究，其构建的 BLdtugRPA24 菌株在以甘油为碳源的 pH-stat 流加发酵中积 累 5.2 g/L 胸苷[2,13,15-17]。因此，可以通过代谢 工程方法 定向改造 大肠杆菌 使其大量 积 累 胸苷。


Fig. 1 Thymidine biosynthetic pathway. Genes and their corresponding enzymes were shown as follows: carAB , carbamoylphosphate synthetase; pyrBI , aspartate carbamoyl transferase; pyrC , dihydroorotase; pyrD , dihydroorotate oxidase; pyrE , orotate phosphoribosyltransferase; pyrF , OMP decarboxylase; pyrG , CTP synthetase; pyrH , nucleoside phosphate kinase; nrd , nucleotide diphosphate reductase; ndk , nucleoside diphosphate kinase; dut , deoxyribonucleotide triphosphatase; thyA , thymidylate synthase; ushA , 5’-deoxyribonucleotidase; deoA , thymidine phosphorylase; tdk , thymidine kinase; udp , uridine phosphorylase. The overexpressed genes in this study are indicated by the bold arrows. This figure is consulted with the figure of Lee et al [13].

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

菌株与质粒见表 1。Escherichia. coli BL21 (D E 3) 作为基因  敲 除和质粒表 达的宿主菌 ， E. coli DH5α 作为质粒构建的宿主菌。

1.2 试剂与仪器

酵母抽提物、胰蛋白胨、基因组提取试剂 盒、DNA 胶回收试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒 等均购自上海生工生物工程有限公司。快速高 保真 DNA 聚合酶 Fast pfu 购自北京全式金生物 技术有限公司。限制性内切酶和 T4 DNA 连接 酶均购自加拿大富酶泰斯 Fermentas 公司。其他 试剂为国产分析纯。

仪器：TU1901 双光束紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限公司)；BLBIO-5GJ 发酵罐 (上海百仑生物科技有限公司)；SBA40E 生物传感 仪 (山东省科学院生物研究所)；HP 1100 LC 高效

液相色谱仪 (Agilent 188 Technologies, USA)。

1.3 发酵培养

种子培养基：10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母 抽提物，5 g/L 氯化钠； 摇瓶发酵培养基：10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母抽提物，5 g/L 氯化钠， 0.1 mol/L 3-吗啉丙磺酸 (MOPS)，10 g/L 葡萄糖； 流加发酵初始培养基：15 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 酵 母抽提物，5 g /L 氯化钠，0.4 g/L MgSO 4·7H 2O, 20 g/L 葡萄糖；流加培养基：454.5 g/L 葡萄糖与 22.7 g/L 酵母抽提物混合液。上述培养基在需要时添加 50 μg/mL 氨苄青霉素和 20 μg/mL 四环素。 摇瓶培养：取–80 ℃保藏的种子培养液接入 50 mL LB 种子培养基中，37 ℃、220 r/min 培养。 待 OD 长到对数中后期，以 OD 600 为 0.05 的初始 接种量接入到 100 mL 的发酵培养基中，37 ℃、 220 r/min 条件下培养。OD 600 达到 0.4 时，添加终 浓度为 0.5 mmol/L IPTG 诱导质粒上基因的表达。 


表 1 菌株与质粒



发酵罐培养：种子液生长至对数中期时， 以 5%的接种量接种到含有 2.5 L 发酵液的 5 L 发酵罐中，在 37 ℃条件下进行培养。OD 600 达 到 0.6–0.8 之 间时， 添加 IPTG 至终 浓度为 0.5 mmol/L 。通过溶氧和转速的偶联控制使溶氧 水平保持在 20%–30%之间, 通气量为 1 vvm 。 通过添加 10% NH 4OH 调节发酵液 pH 维持在 7.0。当葡萄糖浓度低于 5 g/L 时，添加 110 mL 流加培养基。发酵结束时，补料添加的葡萄糖 大约为 250 g ，最终体积在 2.9–3.0 L 之间。

1.4 基因敲除

如图 2 所示，本实验先用 PCR 扩增出待敲除基

因的上游 F 和下游 D 各  片 段，通过融 合 PCR 扩 增出片 段 F-tet-D

[19]

。将片段 F-tet-D 电转入含有 pTKRED 质


粒的感受态细胞中，利用 red 重组系统进行同源重 组，筛选出 tetA 片段取代了待敲除基因的菌株[20]。 其后诱导Ⅰ-Sce Ⅰ酶表达，在 F-tet-D 片段内的 Ⅰ-Sce Ⅰ酶切位点进行酶切，导致该位点发生 DNA 双链断裂。断裂的基因组通过设计的 30 bp 同源片段进行同源重组，通过菌落 PCR 验证筛选 出目的基因敲除菌株[21]。敲除成功的菌落通过在 42 ℃下试管培养，可以消除胞内的 pTKRED 质粒。 


图 2 基因敲除

Fig. 2 Gene disruption.

1.5 质粒的构建

首先提取 Escherichia coli BL21 (DE3) 基因 组 DNA 并以其为模板，按照引物 ushA-F/ushA-B 进行 ushA 基因的 PCR 扩增。纯化后的 ushA 基 因片段与载体 p5C 分别经 Sac Ⅰ和 Sma Ⅰ双酶 切，酶切产物纯化后用 T4 DNA 连接酶连接得 到表达载体 pLS1，并电转化到感受态细胞，涂 布含有氨苄青霉素的 LB 平板，挑选抗性克隆， 提质粒进行 Sac Ⅰ和 Sma Ⅰ双酶切鉴定，对鉴定 正确的质粒送测序验证。用同样方法，在 pLS1 质粒上依次插入了基因 thyA 、dut 和 ndk ，得到 质粒 pLS4。pLS4 质粒上的 ushA 、thyA 、dut 和 ndk 四个基因的转录由强启动子 P trc 控制。采用 同样的方法在 pTRC99A 上克隆了 nrdA 和 nrdB 基因，得到 pLM2 质粒。pLM2 上编码核苷二磷 酸还原酶的 nrdA 和 nrdB 基因的转录也被强启 动子 P trc 控制。  引物见表 2。

1.6 数据测定

1) 菌体密度：取发酵液经适当稀释，在 600 nm 下测定吸光度，本文中所有数据结果均为 3 组 平行实验的平均值。2) 发酵液中的残余葡萄糖： 发 酵 液离心 取 上清， 稀 释到适 当 倍数， 用

SBA40E 生物传感仪测定残余葡萄糖。3) 胸苷 的测定：发酵液离心取上清，膜过滤后用高效 液相色谱直接测定发酵液内胸苷的浓度。色谱 条件为：luna C18(2) (5 µm ，150 mm×4.6 mm) 为分离柱， V ( 乙腈 ) ： V ( 三氟乙酸 ) ： V (水)=4∶0.05∶95.5 为流动相，流速为 1 mL/min ， 测定波长为 260 nm

[13]。4) 胞内 CTP 和 dUTP


用高氯酸法抽提 [22] ，色谱条件为： Agilent ZORBAX SB-Aq (5 μm ，250 mm×4.6 mm)为分 离柱，0.2 mol/L 磷酸盐缓冲液 (含有 10 mmol/L 的四丁基溴化铵)：乙腈=89.5∶10.5 为流动相， 流速为 1 mL/min ，测定波长为 254 nm [23]。 



表 2 过表达基因引物



2 结果与分析

2.1 基因敲除菌株的构建

F-tet-D 通过双交换同源重组整合到基因组 上，PCR 产物如图 3A 所示。tetA 经过分子内同 源重组被成功剔除出基因组，其相应的 PCR 产 物如图 3B 所示，并将 PCR 产物进行测序验证 基因敲除成功。验证结果正确的菌落在 42 ℃培 养以消除 pTKRED 质粒，得到菌株 BS01。同样 的方法依次敲除了 tdk 、udp 、pgi 和 pyrL 基因。

2.2 胸苷磷酸化酶 (deoA )、胸苷激酶 (tdk ) 和 尿苷磷酸化酶 (udp ) 基因敲除对菌株生产胸 苷的影响

补救途径合成嘧啶核苷酸需要胸苷磷酸化 酶、胸苷激酶、尿苷磷酸化酶，而这 3 个酶也催 化胸苷分解为胸腺嘧啶和生成 dTMP 。在野生型


菌株的基础上，敲除基因 deoA 、tdk 和 udp ，得 到 BS01 (Δde   oA ) 、 BS02 (ΔdeoA Δtdk ) 和 BS03 (ΔdeoA Δtdk Δudp )。对这 3 株菌进行摇瓶发酵，通 过高效液相色谱法对发酵液进行检测。BS01 和 BS02 在整个发酵过程中未检测到胸苷的生成， 这说明胸苷的分解途径还没有完全被阻断 。 BS03 在发酵过程中的最大比生长速率为 1.44 h –1， 9 h OD 600 达到 7.86，发酵 9 h 消耗了 10 g/L 的 葡萄糖，积累了 22.8 mg/L 的胸苷。发酵 24 h 时胸苷浓度为 21.6 mg/L ，仅有微量下降，如图 4 所示。发酵结果表明，在同时敲除这 3 个基因 的情况下才能有效截断胸苷分解途径，使细胞 积累少量的胸苷。这和 Lee 等[13]的研究结果一 致，他们构建的遗传背景类似的菌株 BLdtu 也 消除了胸苷的降解，在以甘油为碳源的丰富培 养基中可以积累 12 mg/L 的胸苷。 



图 3 菌落 PCR 验证

Fig. 3 colony PCR verification. (A) The fragments amplified by F1/T2 and T1/B3 were 1 350 bp and 1 201 bp. The T1 and T2 were internal primers of tetA . (B) The fragment after tetA disrupted was about 650 bp.



图 4 BS03 发酵曲线

Fig. 4 Fermentation using strain BS03.

2.3 pgi 和 pyrL 基因敲除对生产胸苷的影响

为了增加胸苷前体物的供给，敲除了 pgi 基 因，构建了 BS04 菌株。BS04 发酵结果如图 5 所 示，对数期的比生长速率为 0.53 h –1

，发酵 24 h 进入稳定期，葡萄糖被耗尽。与菌株 BS03 相比， 菌株 BS04 的比生长速率下降了 63%，发酵时间 增长，但最终菌体密度较高 (44 h 的 OD 600=15.2)。 最终胸苷的浓度为 78.7 mg/L ，相对于菌株 BS03 的产量提高了 3.6 倍。

在嘧啶核苷酸从头合成途径中，核苷二磷

图 5 BS04 和 BS05 发酵曲线

Fig. 5 Fermentation using strains BS04 and   BS05.

酸还原酶和二氢叶酸还原酶都需要 NADPH 为 辅因子，核糖-5-磷酸是嘧啶核苷酸和嘌呤核苷 酸的共同前体，而核糖-5-磷酸和 NADPH 都是 在磷酸戊糖途径合成的。pgi 基因是 EMP 途径 的必需基因，敲除 pgi 能够阻止葡萄糖-6-磷酸 异构为果糖-6-磷酸，使葡萄糖-6-磷酸流向磷酸 戊糖途径，增加磷酸戊糖途径的通量，为胸苷的 合成提供更多的前体物。Hyeon Cheol Lee 等[16] 在 BLdtug24 的基础上敲除了 pgi 基因，构建出 BLdtugp24 菌 株。采用 pH-stat 流 加方式 ， BLdtugp24 胸苷产量达到 1.02 g/L ，比出发菌株 BLdtug24 的产量提高了 4.86 倍。


天冬氨酸氨甲酰基转移酶是嘧啶核苷酸从 头合成途径的第一个关键酶，pyrB 和 pyrI 分别 编码其催化亚基和调节亚基，构成一个操纵子。 pyrB 上游有一段调控序列 pyrL ，其序列内部包 含有一个不依赖于ρ因子的转录终止子。研究表 明，在胞内 UTP 浓度较高时，大约 98%的转录 均在此位点终止[24]。敲除 pyrL 调控序列可以解 除 UTP 对 pyrBI 操纵子转录的弱化作用[25]。为 了 pyrBI 可以组成型表达，在 BS04 基础上敲除 了 pyrL 调控序列，构建了 BS05 菌株。如图 5 所示，该菌株对数期的比生长速率与 BS04 一 致，发酵 24 h 时进入稳定期，pyrL 敲除对菌体 生长速率几乎没有影响。发酵产物检测最终胸 苷的产量达到 90.5 mg/L ，与 BS04 相比，菌株 BS05 胸苷产量提高了 15%。



表 3 基因过表达对胸苷生产的影响

metabolites were obtained at mid-log phase. 1.0 OD 600 = 0.45 g DCW/L.

大肠杆菌胸苷合成途径的 ushA 、thyA 、dut 、ndk 、 nrdA 和 nrdB 六个基因来增加胸苷的合成通量，BS08 菌株在摇瓶条件下可以积累 272 mg/L 胸苷，在分 批补料发酵条件下，胸苷的产量达到 1 248.8 mg/L ， 生产率为 15.61 mg/(L·h)，得率为 12.5 mg/(g glucose)。

REFERENCES

图6 BS08分批补料发酵

Fig . 6 Fed-batch fermentation using strain BS08.

而是敲除 purR 、pepA 和 argR 三个基因以提高

carAB 操纵子的转录水平。该菌株更适合利用甘油 为底物生产胸苷，在 pH-stat 流加发酵条件下积累 了 5.2 g/L 胸苷[2]。因此在代谢工程改造方面，BS08 的胸苷合成通量仍有很大的改进空间，这些问题 将在后续的工作中进一步研究与完善。

3 结论

本实验以 E. coli BL21 为出发菌株，敲除了嘧 啶核苷酸回补途径的 deoA 、tdk 和 udp 3 个基因， 使 BS03 能够积累 21.6 mg/L 胸苷。在 BS03 基础 上敲除了 pgi ，增加合成胸苷的前体物来源，BS04 可以积累 78.7 mg/L 胸苷，进一步敲除了 pyrL 序 列，使 pyrBI 组成型表达，BS05 胸苷的产量达到 90.5 mg/L ，较 BS03 提高了 4.2 倍。随后过表达了

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