pH值对普鲁兰多糖发酵的影响及其机理分析

普鲁兰多糖是一种微生物胞外多糖，其化学结构是以麦芽三糖为单体聚合而成[1]，主要由出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）发酵产生。麦芽三糖通过α-1，6糖苷键结合起来的高分子聚合物，其分子量（Mw）分布范围广泛，通常在 4.8×104Da～2.2×106Da，约480个麦芽三糖单体[1]，培养条件、培养基成分以及生产菌株变化的影响，聚合度大小随之改变[2]。普鲁兰多糖因其具备无毒且生物安全的特性，被广泛的应用于医药、食品、化妆品等领域[3]，其优良的理化性质决定了其具备广阔的应用前景。

普鲁兰多糖合成途径中的3种关键酶分别是α-磷酸葡萄糖变位酶（PGM），UDPG焦磷酸化酶（UGPase），磷酸葡萄糖基转移酶[4]。Shingel报道称尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）是合成普鲁兰多糖必要的前体物[5]。UDPG是由PGM和UGPase催化转化不同碳源所得的[6]。Catley等[7]提出了短梗霉多糖形成多糖的进程中，葡萄糖基转移酶催化下UDPG中的葡萄糖残基转移，并与脂质分子连接形成普鲁兰多糖链。就目前研究来看[8-9]，出芽短梗霉以蔗糖为碳源发酵，普鲁兰多糖转化率最高。因此推测普鲁兰多糖合成的可能途径，如图1所示。因此，PGM和UGPase的活性都对普鲁兰多糖合成起着至关重要的作用[10]，本文研究了不同pH值条件对普鲁兰多糖发酵的影响，并提出双阶段调控pH值来进一步提高普鲁兰多糖产量的方法，同时以UDPG含量及PGM和UGPase活性的变化来分析普鲁兰多糖合成机理。

图1 普鲁兰多糖合成大致代谢流程
Fig.1 proposed pathway of pullulan synthesis in A.pullulans

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌种

出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）：保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏号：CGMCCNO.7055。

1.1.2 主要仪器设备

08-F25型5 L自动发酵罐：镇江格瑞生物工程有限公司；TDL-5-A型高速离心机：上海安亭科学仪器厂；Agilent 1200液相色谱分析仪：美国安捷伦公司；Infinite Ⓡ200 Pro NanoQuant酶标仪：瑞士Tecan公司。

1.1.3 培养基

种子培养基（g/L）：蔗糖100、酵母浸粉3、（NH4）2SO41、K2HPO42、MgSO4·7H2O 0.4、NaCl 2.5、FeSO4·7H2O 0.05，pH 6.5，121 ℃灭菌 20 min。

发酵培养基（g/L）：蔗糖 150、蛋白胨 5、K2HPO47、MgSO4·7H2O 0.4、NaCl 3、FeSO4·7H2O 0.05，按0.0001%量添加泡敌（植物油），121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 分批发酵培养方法

在培养好的斜面上挑取一环孢子接入装液量为100 mL的500 mL挡板瓶中，28℃，180 r/min摇床恒温培养28 h～32 h，制得种子液。将种子液以3%的接种量接入装液量为3 L的5 L发酵罐中，通风比为1：1.25，发酵前24 h温度维持在32℃，24 h后温度调节到28℃，罐压恒定在0.02 MPa，初始pH6.0，转速：400 r/min。

1.2.2 发酵试验分析方法

1.2.2.1 多糖的测定[11-12]

将发酵液5 000 r/min离心20 min后，取30 mL上清液加入两倍体积乙醇，搅拌均匀，静置1 h后抽滤，所得多糖置于105℃干燥至恒重。

1.2.2.2 生物量的测定[13]

发酵液离心后，将上清液倒出，随后用蒸馏水洗涤菌体2次～3次后，所得菌体于80℃烘箱至恒重，称重。

1.2.3 无细胞提取液制备

量取15 mL发酵液，在4℃、10 000 r/min条件下离心10 min，用冷冻0.9%NaCl溶液将菌体洗涤3次后，将菌体重悬于1.0 mL预冷的1 mol/L的Tris-HCl（pH7.6）缓冲液。使用超声破碎仪破碎30 min后，在4℃、10 000 r/min条件下离心10 min，去除细胞碎片。总蛋白含量以Bradford方法测定[14]。

1.2.4 尿苷二磷酸葡萄糖含量的测定[15]

利用安捷伦带有紫外检测器的高效液相色谱检测尿苷二磷酸葡萄糖含量。液相条件：色谱柱：J&KCHEICA HPLC column C18（5 μm，250 mm ×4.6 mm i.d.），流动相：pH6.0的40 mmol/L三乙铵醋酸盐缓冲溶液，柱温：22 ℃，流速：1 mL/min，进样量：10 μL。

1.2.5 磷酸葡萄糖变位酶酶活的测定（PGM）

在翟自立[16]等的方法上进行改进。反应混合物 60 mmol/L Tris-HCl（pH7.0），7 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L NADP，5 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L 葡萄糖-1，6-二磷酸，2U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和30μL适量稀释的无细胞提取液，反应2 min，加入0.1 mmol/L葡萄糖-1-磷酸至终体积250 μL。在340 nm下测定光密度，一个酶活力单位定义为：每分钟转化1 μmol底物的酶量所需酶量。

1.2.6 UDPG焦磷酸化酶酶活的测定（UGPase）

在Duan等[4]的方法上进行改进。反应混合物包括 60 mmol/L Tris-HCl（pH7.0），8 mmol/L MgCl2，1 mmol/L UDPG，2.1 U磷酸葡萄糖变位酶（PGM），4 U 6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH），0.4 mmol/L NADP+，4 mmol/L无机磷酸盐和30 μL适量稀释的无细胞提取液至终体积250 μL。在30℃条件下开始反应。在340 nm下测定吸光值。一个酶活力单位定义为：每分钟转化1 μmol底物的酶量所需酶量。

1.3 统计分析

每个试验处理独立重复3次，采用Microsoft Excel 2007、origin8.5统计软件对所有数据进行数据处理和显著性分析。

2 结果与讨论

2.1 不同初始pH值对普鲁兰多糖发酵的影响

利用 500 mL 挡板瓶对初始 pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5条件下发酵普鲁兰多糖进行研究，结果如表1所示。

表1 不同初始pH值对普鲁兰多糖发酵的影响
Table 1 Effect of initial pH on pullulan fermentation

根据表1可以看出，在初始pH 6.0条件下，普鲁兰多糖的产量最高达到（63.75±0.09）g/L，同时生物量达到（9.23±0.31）g/L。初始pH值调至7.5时普鲁兰多糖产量和生物量均最低，发现普鲁兰多糖产量随初始pH值降低而逐渐增高，由此可推断出芽短梗霉在偏弱酸性环境下更利于合成普鲁兰多糖。而初始pH5.5时普鲁兰多糖产量又低于初始pH6.0，故普鲁兰多糖发酵初始pH值过低不利于多糖合成。因此，选择初始pH6.0作为普鲁兰多糖发酵初始pH值条件。

随后，对初始pH6.0条件下发酵普鲁兰多糖进行5 L罐验证试验，各发酵参数的变化趋势如图2所示。

图2 初始pH6.0对普鲁兰多糖发酵的影响
Fig.2 Effect on fermenting pullulan under condition of initial pH6.0

由图2可以看出在发酵32 h～64 h大量合成普鲁兰多糖，而64 h后，普鲁兰多糖产量趋于稳定。生物量在24 h后进入稳定期，而64 h后再升高。不难推测，随着多糖合成减慢甚至基本停滞，碳代谢向出芽短梗霉菌体合成方向转移，导致生物量不断升高。还可以看出随普鲁兰多糖产量增加，由于有机酸合成加剧，发酵pH值也随之逐渐下降。在64 h后pH值逐渐趋于平缓，而此时多糖合成量亦趋于停滞，可见当pH值降低至4.5以下甚至更低时，不利于普鲁兰多糖合成。因此，控制pH值发酵恒定在6.0、5.5、5.0研究普鲁兰多糖发酵的影响。

2.2 不同恒定pH值对普鲁兰多糖发酵的影响

不同恒定pH值对普鲁兰多糖发酵的影响见图3。

图3 不同恒定pH值对普鲁兰多糖发酵的影响
Fig.3 Effect on biomass by fermented pullulan under different stable pH value

利用5 L发酵罐分别对恒定pH6.0、5.5、5.0对普鲁兰多糖发酵的影响进行研究，由图3（A）可以看出维持发酵pH值恒定延长了出芽短梗霉对数生长期的时间，恒定pH值为6.0和5.5的两试验组在发酵48 h后，生物量高于初始pH6.0该空白组，同时进入稳定期，生物量分别为（10.24±0.33）g/L和（11.89±0.316）g/L，始终维持恒定pH值至6.0和5.5，虽然生物量高，但是菌体生长速率变低。而恒定pH5.0组不仅菌体生长缓慢，并且生物量一直处于较低水平，可见在普鲁兰多糖发酵开始阶段，pH值偏低不利于菌体生长。另外，维持恒定pH6.0、5.5、5.0这3组的普鲁兰多糖产量始终低于初始pH6.0组，见图3（B），并且根据pH值由高到低，终产量也呈由高到低的趋势，终产量依此为（45.73±2.41）、（39.15±1.45）、（33.21±2.1）g/L。由此可见在发酵过程中pH值始终恒定于某一特定值对普鲁兰多糖发酵起到抑制作用，降低普鲁兰多糖产量。

2.3 不同双阶段控制pH值对普鲁兰多糖发酵的影响

由于始终将pH值控制恒定为某一特定值对普鲁兰多糖产量并无明显提高。同时在监控初始pH6.0组发酵普鲁兰多糖过程中pH值的变化趋势，可发现当发酵进行至对数生长期（即发酵24 h）后，普鲁兰多糖合成量急剧增加，此阶段发酵pH值范围在4.5到5.5范围。因此对采用双阶段调控pH值方式发酵普鲁兰多糖进行研究。不同双阶段控制pH值下的普鲁兰多糖产量及生物量见表2。

表2 不同双阶段控制pH值下的普鲁兰多糖产量及生物量
Table 2 pullulan and biomass under fermented condition of twophase controlling pH valve

以初始pH6.0为空白组，发现第二阶段pH值控制在4.5组（即pH6.0～4.5组）的生物量在发酵结束时最高，达到（16.75±0.36）g/L，而第二阶段控制在5.0，5.5（即 pH6.0～5.0组、pH6.0～5.5 组）的生物量亦高于空白组，可见在菌体生长进入稳定期后调节pH值维持恒定更利于菌体生长，并且pH值较低时菌体合成量越高。但从表2，可看出pH6.0～5.0试验组的产量最高，较空白组高出22.5%，而pH6.0～4.5多糖产量不如pH6.0～5.0组，证明pH6.0～4.5组相较于pH6.0～5.0组更适于菌体合成，而菌体合成普鲁兰多糖的能力弱于pH6.0～5.0组。

2.4 不同pH值条件对磷酸葡萄糖变位酶（PGM）和UDPG焦磷酸化酶（UGPase）活性的影响

pH值对UDPG焦磷酸化和磷酸葡萄糖变位酶酶活性的影响见图4。

UDPG焦磷酸化酶（UGPase）是催化葡萄糖-1-磷酸与UTP生成普鲁兰多糖合成重要前体尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）的关键酶（如式 1），UGPase活性可直接影响UDPG的合成。其中葡萄糖-1-磷酸由磷酸葡萄糖变位酶（PGM）催化6-磷酸葡萄糖所得，因此PGM活性也会间接的影响UDPG的合成。所以这种酶普鲁兰多糖发酵起到尤为重要的影响。

图4 pH值对UDPG焦磷酸化和磷酸葡萄糖变位酶酶活性的影响
Fig.4 Effect of different pH on UDPG-pyrophosphorylase and phosphoglucomutase activity

从图4总体可看出，在pH6.0～5.0条件下发酵80 h后UGPase和PGM的活性均高于其他pH条件下的活力，同时此条件下的多糖产量也高于其他组，这一结果显示这些pH值条件下的酶活力与普鲁兰多糖的生产规律相似，因此证明了这两种酶对多糖生产的影响。在初始pH6.0条件下UGPase和PGM的活性与pH6.0～4.5组相近，同时普鲁兰多糖产量相近，分别为（65.21±2.78）g/L 和 63.21 g/L，而此时初始pH6.0条件下的发酵pH值为4.76左右，证明这两种酶的活性对pH值变化较为敏感。在后期控制pH值恒定的四组中酶活力受pH值影响，随pH值由低到高，呈现一种先降低后升高的变化趋势，并在pH5.0表现出最高比活力，同时可以观测出普鲁兰多糖产量呈现这一态势。从而可在酶学上印证后期调节pH值至5.0更利于普鲁兰多糖合成。而生物量的变化受酶活影响并不十分明显，初始pH值6.0组在发酵80 h时酶活与pH6.0～4.5酶活基本一致而生物量却差异明显。后期调控pH值的四组，生物量则与pH值的变化相关，可看出后期pH值偏低更利于菌体生长。

2.5 双阶段pH6.0～5.0对普鲁兰多糖发酵的影响及机理分析

双阶段控制pH值对普鲁兰多糖发酵的影响见图5。

图5 双阶段控制pH值对普鲁兰多糖发酵的影响
Fig.5 Change fermenting pullulan under two-phase control of pH value

利用5 L发酵罐对pH6.0～5.0组进行产量验证，每隔8 h取样一次。普鲁兰多糖多糖合成及生物量累积趋势如图5所示，普鲁兰多糖产量在发酵80h时达到最高，相较于仅调节初始pH6.0发酵时间缩短8 h左右，同时产量也有显著提高，此时普鲁兰多糖产量达到（92.5±2.41）g/L，生物量达到（13.95±0.35）g/L。发酵80 h后继续反应，普鲁兰多糖产量开始下降，同时生物量增高，发酵96 h生物量增高值（14.91±0.29）g/L，而普鲁兰多糖产量下降至（81.33±2.01）g/L。产生此现象可能是由于普鲁兰多糖积累到一定水平，对其合成产应产生抑制作用，从而使普鲁兰酶开始分解普鲁兰多糖，为菌体合成提供碳源，从而使生物量有明显增长。UDPG含量的变化趋势也同样印证了这一点，UDPG含量先处于较高水平，随普鲁兰多糖合成加剧，UDPG含量迅速下降并在多糖产量达到最高时处于最低谷，在多糖产量降低时又有些许上升。又经相关性检验得出两者相关性系数为-0.905，则普鲁兰多糖产量与UDPG含量在0.01水平上显著相关，由于相关性系数为负，所以两者呈显著负相关关系。

3 结论

经上述试验证明，分阶段控制pH值对于普鲁兰多糖合成以及出芽短梗霉菌体生长具有显著的促进作用。分阶段控制pH值的第一阶段即初始pH值调节为6.0利于菌体生长和生物量积累，而第二阶段控制pH值恒定于5.0诱导发酵，促进普鲁兰多糖合成，同时发酵终止时间提前8 h，最终生物量到达（13.87±0.89）g/L，终产量达到（92.5±2.41）g/L左右。经过验证pH6.0～5.0此双阶段pH值调控方式可使PGM和UGPase活性高于其他控制阶段，并且得出普鲁兰多糖产量与UDPG含量变化成显著负相关关系。

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