摘要：主要研究了沉淀法分离提取发酵液中多粘菌素E（Colistin sulfate）的生产工艺。对超滤液热絮凝、吸附脱色、碱性沉淀以及浓缩液二次脱色等工艺参数进行了考察，结果表明：工艺最佳条件：超滤液90～95℃热絮凝5min后，板换快速冷却，复合脱色处理：加碳量0.1%、亚硫酸盐0.5%～1.0%，沉淀条件：pH值为11.0～12.5、15～30℃、静置1h，浓缩液脱色添加0.4%～0.8%活性炭，处理0.5h，最高收率达到90%以上，成品各项指标符合EP生产标准。通过连续稳定性试验对各个参数进行验证，得到了适用于工业化生产的多粘菌素E分离工艺。
关键词：硫酸粘杆菌素;沉淀分离法;碱性多肤;絮凝
中图分类号：TQ923 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）22-0186-04
1 引言
多粘菌素E是一种碱性多肽类抗生素，兽用硫酸粘菌素商品为其硫酸盐。目前生产中主要是连续树脂法分离提取[1，3]，但此法污水量大，工艺复杂，收率低。文献报道中的对多粘菌素E分离技术较多[2，4，5]，但都不能形成可行性的生产工艺。活性炭是一种传统的脱色剂，其生产工艺简单，可操作性强，效率高，是抗生素生产提取工艺常见脱色方法。沉淀法分离抗生素是一种传统方法，具有操作简单，但由于多粘菌素的碱性不稳定性[5，6]，收率不稳定，尚无利用此法的生产报道。作者在前期研究在碱性沉淀法[8]上做了大量基礎工作，本文通过对利用传统的活性炭预处理和碱性沉淀法分离多粘菌素E进行研究，优化各项工艺操作参数，并与膜分离[2]等工艺结合，获得了能够替代树脂法的多粘菌素E生产工艺。
2 材料与方法
2.1 材料
多粘菌素E标品（BR）由天津施瑞克公司提供，硫酸及硫酸盐等其他试剂为国产分析纯，活性炭为福建大林森木质活性炭。
2.2 实验方法
（1）多粘菌素E测定高效液相色谱法（HPLC），文献[9]改进方法。
（2）蛋白相对含量测定方法采用紫外分光光度计，设定波长280nm，物料稀释50～100倍测定吸光值。
（3）色素相对含量测定方法采用可见分光光度计，设定波长400nm测定吸光值。
3 结果与分析
3.1 多粘菌素E超滤液预处理
3.1.1 热处理
对超滤液进行热处理（结果见图1），试验过程中，加热温度80℃以上时，蛋白絮凝量逐渐增多，色素量降低，当温度高于90℃左右出现拐点，色素去除率下降，蛋白去除率升高减缓，同时降解率快速升高。
结果表明：温度在90℃左右最佳，可除去较多的杂质，收率保持在95%以上，褐变反应加快。因此，热处理过程应快速升温及降温，尽量缩短温度对效价和褐变反应的影响。
3.1.2 脱色处理
陶瓷清液90～95℃热处理，活性炭和还原剂复合影响效果明显（图2），色素去除率与还原剂量呈正相关，蛋白去除率与之无关，当还原剂量超过1%，对收率产生负影响。结果表明，亚硫酸盐对褐变反应速率抑制及还原性脱色有较好影响，但过量盐加入，可能影响多粘菌素E的电荷状态或构象，稳定性降低导致降解发生。
活性炭对热处理后滤液的脱色效果（图3），活性炭加入量和杂质去除率、效价损失率呈正相关。结果表明：较少的活性炭对效价也有明显的影响，但其脱色及去蛋白效果又很显著，因此保证收率的前提下0.1%的炭量处理为最佳。
3.2 多粘菌素E碱性沉淀过程
3.2.1 不同条件对多粘菌素E稳定性的影响
前期的试验数据和药典记录一致，碱性条件下，尤其是溶液或湿晶体状态下，硫酸粘杆菌素降解受pH值、温度、时间等因素影响明显。
碱性pH值条件下，多粘菌素E的稳定性较差，沉淀絮凝和降解反应同时发生。pH值和温度对稳定性的影响（见图4，图5），结果表明：pH值低于11.5的时理论降解率反而更高，pH值在11.5～12.0，沉降过程的理论降解率较低。结果说明，pH值和温度都偏低时，多粘菌素E多呈溶解短肤，更易降解;而pH值和温度过高，直接导致碱性降解反应速率加快。
这与试验过程观测到的情况一致，条件前期多粘菌素的形成絮凝速率和降解率呈负相关，而调碱后期，尤其是较高温度，絮凝沉淀快速形成，降解率反而降低。多粘菌素E呈游离短肽时，更易降解，降解量的累计和时间呈正相关（图6）。结果表明：在试验过程，调碱操作时间越短，降解率越低，0.5～1h的生产操作时间可以降理论降解率控制在10%以内。
3.2.2 不同条件对多粘菌素E沉淀收率的影响
pH值和温度对沉降收率的影响（见图7，图8），结果表明：pH值在11.5左右，温度在25℃左右，沉降收率分别达到最高。
沉降时间对收率的影响（见图9），结果表明：沉降时间在1h左右，收率达到最高85%～86%。而在保护剂的作用下（见图10），0.1%～0.2%的还原性保护剂可以和环境中的氧化性基团作用，提高活性短肽的惰性，收率提高到88%～89%。
3.2.3 不同条件对多粘菌素E浓缩液脱色处理效果的影响
超滤液在pH值为4.0时，不同活性炭量的脱色结果（见图11），色素的去除率同活性炭量呈正相关，少量活性炭对色素的吸附效率较高，过量加入活性炭的色素吸附效率明显下降;脱色时间的色素去除率的影响较小，但炭加入过多，脱色时间较长，对效价损失影响明显，脱色时间控制在0.5h左右最适。
采用0.6%活性炭脱色，考察pH值对活性炭的脱色效果影响（见图11）。结果表明：相对较高的pH有利于色素的去除，但效价损失率也较高。结果可见，pH值为4.0左右色素去除率较高，同时效价损失率明显降低。
氧化剂脱色与活性炭的复合脱色作用结果（图12），复合处理比活性炭单独处理色素去除率提高15%左右，氧化剂与有机物活性基团的反应能力较强，极易对效价产生影响，使用量不宜过多。
不同活性炭量对复合脱色效果的影响（见图13），结果表明，活性炭量对复合处理色素去除率影响较小，但对效价损失影响较大。
不同浓度浓缩液对复合处理的脱色影响（见图14），结果表明，浓缩液效价在400～800万单位之间，效价高低和脱色效果呈负相关。这说明高效价浓缩液粘度较大，脱色过程色素与活性炭的表面接触几率降低，同时多粘菌素E被活性炭吸附后，活性炭的吸附能力进一步降低。
3.3 工艺稳定性试验
采用以上试验最佳结果进行多批试验，同时对脱色后浓缩液进行高温喷干形成成品。对试验各步收率进行统计以及成品各项指标结果（见表1，表2）。
连续进行多批工艺稳定性验证，总收率收率和干粉指标都达到预期目标，工艺各阶段质量控制稳定。
4 结论
（1）工艺最佳条件：超滤液90～95℃热絮凝5～10min后，冷却过滤，一次脱色加碳量0.1%、亚硫酸盐0.5%～1.0%，沉淀条件pH值为11.0～12.5、15～25℃、静置1h，浓缩液添加0.4%～0.8%活性炭脱色0.5～1h，最高收率达到90%以上。
（2）少量的亚硫酸盐类保护剂和活性炭的复合处理效果明显，但生产应用还有待进一步生产验证。
（3）脱色后喷干成品各项指标达到EP标准，通过试验连续验证，该工艺流程简单，完全可以达到生产要求。
参考文献：
[1]顾觉奋，寇晓康，杜振宁，等.离子交换与树脂吸附在制药工业上的应用[M].北京：中国医药科技出版社，2008.3
[2]杨亚勇，刘珍奇，蒋顺进.超滤膜在多粘菌素E预处理中的应用[J].中国抗生素杂志，2001（4）：244～245.
[3]邢维玲，周希贵，王贺祥，等.离子交换层析法提取黏杆菌素的研究[J].中国兽医杂志，2002（11）：44～46.
[4]佟斌，劉桂敏，吴兆亮，等.泡沫分离提取多粘菌素E的工艺研究[J].食品工业科技，2007，28（5）：153～155
[5]孟杰，刘桂敏，赵艳丽，等.硫酸多黏菌素E水溶液的表面张力和泡沫性能的研究[J].中国抗生素杂志，2007，32（11）：696～672.
[6]常晓菲，王宏，王静.硫酸多粘菌素B提取工艺的研究进展[J].北方药学，2011（10）：13～14.
[7]马卫明，佘锐萍，彭芳珍，等.肽类抗生素研究进展[J].中国兽医杂志，2005，6（41）：38～41.
[8]丁绪芹，张劲松，王福岭.沉淀法分离硫酸粘杆菌素工艺研究[J].中国兽药杂志，2013，47（6）：27～30.
[9]解庆镇，顾吉林.多粘菌素E的高效液相色谱测定[J].中国抗生素杂志，1988（13）：36～40.
收稿日期：2019-10-09
基金项目：陕西省科技项目（编号：2018ZKC-173;2019-PT-15）;渭南市科技局项目（编号：ZDYF-SFGG-17-ZSG）
作者简介：马文艳（1981-），女，硕士，主要从事应用微生物及生物医药方面的工作。
通讯作者：潘忠成（1974-），男，博士，主要从事应用微生物及生物医药方面的工作。
