NMN纯化2：一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法

具体实施方式

[0016] 本发明提供了一种烟酰胺单核苷酸的纯化方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0017] 本发明一种β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法的较佳实施例，其包括以下步骤: S100、将经过预处理的β -烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，

收集浓缩的粗品溶液；

S200、将获得的粗品溶液pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的样品溶液；

S300、将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的烟酰胺单核苷酸。

[0018] 本发明是采用反相高效液相色谱法对辅酶I的合成底物烟酰胺单核苷酸进行纯化，通过以固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为盐酸配制而成的溶液和乙醇的色谱柱进行纯化，再进一步浓缩及冻干，获得纯化的烟酰胺单核苷酸。本发明所述的β -烟酰胺单核苷酸的纯化方法操作简单，且能有效除去其他带电荷和极性及其相似的类似物，使所制备出的烟酰胺单核苷酸纯度高、收率大、产量大，适用于大规模工业化生产。

[0019] 优选地，所述步骤SlOO中用于微滤的微滤膜孔径为0.2-1 μ mo具体而言，本发明步骤SlOO中用于微滤的微滤膜孔径为0.5 μπι.微滤的基本原理是筛分过程，在静压差作用下滤除大于10 μπι的微粒，操作压力为

0.7-7bar,原料液在压差作用下，其中溶剂透过膜上的微孔流到膜的低压侧，大于膜孔的微粒被截留，从而实现原料液中的微粒与溶剂的分离。微滤过程对微粒的截留机理是筛分作用，决定膜的分离效果是膜的物理结构、孔的形状和大小。

[0020] 本发明实施例中微滤时采用的微滤膜孔径为0.5 μπι，能初步清除β -烟酰胺单核苷酸粗品溶液中较大的微生物及大颗粒分子，微滤膜允许大分子和溶解性固体(无机盐)等通过，但会截留住悬浮物、细菌及大分子量胶体等物质，对β-烟酰胺单核苷酸粗品溶液进行初步纯化。微滤膜的孔径过大，会使较大微生物和大颗粒分子透过微滤膜，影响初步过滤的效果；孔径过小，会导致β-烟酰胺单核苷酸也无法透过微滤膜，造成产品的损失。

[0021] 另外，本发明所述步骤SlOO中用于纳滤的纳滤膜，其截留分子量为200。进一步地，本发明较佳实施例中采用的纳滤膜孔径为1.5nm,能够截留分子量为200的物质。

[0022] 更优选地，所述步骤SlOO中用于纳滤的纳滤膜为中空纤维膜。

[0023] 纳滤是一种允许溶剂分子或某些低分子量溶质或低价离子透过的过滤方法，其特点在于能在很低的压力下具有较高的除盐性能和截留分子量为数百的物质。本发明采用孔径为1.5nm的滤膜，其截留分子量为200，可以将分子量大于200的物质过滤出来，初步过滤掉烟酰胺单核苷酸中的杂质。并且，将中空纤维膜作为纳滤膜，中空纤维膜外表为纤维状，其具有自支撑作用，可以有效清除烟酰胺单核苷酸制备工艺中所产生的磷酸根残留和其他小分子杂质，使β-烟酰胺单核苷酸得到进一步纯化。

[0024] 经过微滤和纳滤后，收集浓缩的粗品溶液，其浓度为20_30g/L。

[0025] 本发明较佳实施例中，所述步骤S200中磷酸溶液或盐酸溶液的质量浓度为2%~5%，乙醇溶液的质量浓度为5%~30%.更优选地，所述步骤S200中磷酸溶液或盐酸溶液的体积用量为每毫升样品溶液加5-20毫升磷酸溶液或盐酸溶液，乙醇溶液的体积用量为每升流动相加100~400毫升乙醇溶液。

[0026] 具体而言，磷酸溶液或盐酸溶液的质量浓度过高，会导致在梯度洗脱时洗出，若质量浓度过低，会影响物质的分离纯化效果，本发明中采用质量浓度为2%~5%的磷酸溶液或盐酸溶液，可以保证其在梯度洗脱时不被析出的情况下达到高度纯化β-烟酰胺单核苷酸的效果。

[0027] 另外，改变酸的用量会影响峰形，从而影响到检测效果。本发明实施例中采用体积用量为每毫升样品溶液加5~20毫升的磷酸溶液或盐酸溶液，体积用量为每升流动相加100-400毫升的乙醇溶液，可以使峰形对称，减少拖尾现象。

[0028] 本发明较佳实施例中，所述步骤S200用磷酸溶液或盐酸溶液将上一步骤所初步纯化的β -烟酰胺单核苷酸粗品溶液的pH值调至3-7，进样上反相高效液相色谱制备柱，其流动相A为盐酸溶液配成的pH3-7的溶液，流动相B为乙醇。

[0029] 具体而言，反相高效液相色谱法中一般用非极性固定相(如C18、CS);而其流动相常为水或缓冲液，常加入甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间，其适用于分离非极性和极性较弱的化合物，并且PH会影响样品存在的状态，因而影响样品的保留时间。本发明实施例中采用盐酸配成的PH3-7的溶液和乙醇作为流动相，可以有效调节样品的保留时间，使样品从进入色谱柱到流出色谱柱的时间达到最优化，能使样品的分离效果良好。样品的保留时间过长，会使检测的灵敏度降低；样品的保留时间过短，会使烟酰胺单核苷酸与杂质的分离效果降低，影响烟酰胺单核苷酸的纯化。

[0030] 流动相的pH值应该控制在2-8之间，pH值大于8时，可使载体硅胶即固定相溶解，pH小于2时，与硅胶化学键合相易水解脱落。本发明实施例中，pH值为3-7，此时β-烟酰胺单核苷酸能稳定存在，其内部结构不会被破坏，在此条件下，可以使样品的分离效果达到最优化。更优选地，本发明中的流动相的PH值为5，此时样品的纯化效果最佳。

[0031] 本发明所述步骤S200中采用磷酸溶液或盐酸溶液将获得的粗品溶液pH值调至3-7，是因为β-烟酰胺单核苷酸粗品溶液中也含有磷酸根残留，且是采用盐酸配制成的溶液作为流动相Α，本发明中采用磷酸溶液或盐酸溶液来调节粗品溶液的pH值，不会引进新的杂质，并且可以在纯化过程中除去磷酸根等物质。

[0032] 优选地，本发明实施例中步骤S200中，其流动相A相与流动相B相的体积比为2:98-1:1 之间。

[0033] 流动相的比例会对样品的检测效果和纯化效果造成影响。若提高盐酸溶液的用量，降低乙醇的用量，则样品保留时间会增长，可以得到很好的分离，但所测的样品的峰变宽，峰高降低，影响检测的灵敏度；而降低盐酸溶液的用量，提高乙醇的用量，则样品的检测灵敏度较高，但样品的分离效果不佳。通过结合本发明的样品性质和纯化条件，选择按体积比计为2:98-1:1之间的盐酸配制成pH为3-7的溶液与乙醇，可以使样品在分离纯化效果良好的同时提高样品检测的灵敏度。

[0034] 另外，本发明较佳实施例中，梯度洗脱时的洗脱时间为40min。具体可进行2%B〜12%B梯度洗脱纯化。

[0035] 采用梯度洗脱法比等度洗脱法能使出峰效果更加对称无拖尾，且能提高柱效，改善检测的灵敏度。另外将洗脱时间控制为40min可以使样品的保留时间合适，β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化效果最佳。

[0036] 本发明首次采用反相高效液相色谱法对辅酶I的合成底物β -烟酰胺单核苷酸进行纯化，克服了传统的离子交换树脂法的纯化效率低，无法分离与烟酰胺单核苷酸极性等性质相近的类似物，且收率低的问题。

[0037] 下列通过具体实施例对本发明进一步阐释:

本发明包括以下规格色谱柱(柱子直径X长度):5 cm*30cm、15 cm*3O cm、30 cm*30cm。

[0038] 柱温为室温。

[0039] 实施例一:

1.粗品浓缩:

将经过预处理的β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，微滤除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将粗品浓缩至20-30g/L。

[0040] 2.纯化:

纯化条件:

色谱柱:柱子直径和长度为5 cm*30cm ；

固定相:十八烧基娃烧键合娃月父;

流动相:A相:pH为3的盐酸溶液；B相:乙醇；

流速:50-80 ml/min ；

检测波长:260 nm ；

梯度:B%:2% 〜12% (40 min)；

上样量为8-10g。

[0041] 纯化过程:将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调pH至3-7，将色谱柱用30%以上的乙醇冲洗干净后平衡上样，上样量为8-10g，线性梯度洗脱40min，收集目的峰。

[0042] 3.浓缩及冻干: 将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备(截留分子量200的中空纤维膜)纳滤浓缩至100-150g/L，然后用真空冷冻干燥机冻干，得到纯度大于98%的β -烟酰胺单核苷酸，总收率可以达到81.3%ο

[0043] 实施例二:

1.粗品浓缩:

将经过预处理的β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备进行微滤和纳滤，微滤除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将粗品浓缩至20-30g/L。

[0044] 2.纯化:

纯化条件:

色谱柱:柱子直径和长度为15 cm*30cm ；

固定相:十八烧基娃烧键合娃月父;

流动相:A相:pH为5的盐酸溶液；B相:乙醇；

流速:400-500 ml/min ；

检测波长:260nm ；

梯度:B%:2% 〜12% (40 min)；

上样量为60-80g。

[0045] 纯化过程:将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调pH至3-7，将色谱柱用30%以上的乙醇冲洗干净后平衡上样，上样量为60-80g，线性梯度洗脱40min，收集目的峰。

[0046] 3.浓缩及冻干:

将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备(截留分子量200的中空纤维膜)纳滤浓缩至100-150g/L，然后用真空冷冻干燥机冻干，得到纯度大于98%的β -烟酰胺单核苷酸，总收率可以达到82.3%ο

[0047] 实施例三:

1.粗品浓缩:

将经过预处理的β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备进行微滤和纳滤，微滤除掉微生物，纳滤采用截留分子量200的中空纤维膜将粗品浓缩至20-30g/L。

[0048] 2.纯化:

纯化条件:

色谱柱:柱子直径和长度为30 cm*30cm ；

固定相:十八烧基娃烧键合娃月父;

流动相:A相:pH为7的盐酸溶液；B相:乙醇；

流速:2500-3000 ml/min ；

检测波长:260 nm ；

梯度:B%:2% 〜12% (40 min)；

上样量为350-400g。

[0049] 纯化过程:将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调pH至3-7，将色谱柱用30%以上的乙醇冲洗干净后平衡上样，上样量为350-400g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰。

[0050] 3.浓缩及冻干: 将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备(截留分子量200的中空纤维膜)纳滤浓缩至100-150g/L，然后用真空冷冻干燥机冻干，得到纯度大于98%的β -烟酰胺单核苷酸，总收率可以达到80.9%。

[0051] 本发明中通过收集样品的目的峰，当其达到标准时，则将其用膜浓缩设备进行纳滤，再用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的烟酰胺单核苷酸。由本发明所述方法制备的冻干产品β -烟酰胺单核苷酸，其纯度可达98%，总收率可达80%以上，另外由于本发明操作简单，其生产效率也比其它工艺提高了 2倍以上，有效解决了现有技术中磷酸根残留不易解决和制备出的产品纯度低、收率低的问题。本发明具有良好的市场前景，适用于工业化生产纯化的烟酰胺单核苷酸。

[0052] 应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

      NMN半酶法技术欢迎联系13720223167