叶酸是一种水溶性维生素，又称VB 9 ，是大多数生物体内一碳单位的供体，在维持人体机能和代谢活动中发挥着不可或缺的作用，然而，人类是无法从头合成叶酸的，叶酸摄入量不足会引起一系列的疾病。一株高产叶酸的益生菌的发现和应用对于人体健康和天然叶酸的产业化生产都有着举足轻重的作用。
探究乳酸菌叶酸发酵培养的最佳发酵条件是乳酸菌大量制备叶酸的关键。为了使乳酸乳球菌KLDS4.0325能够合成更多的叶酸，东北农业大学乳品科学教育部重点实验室的焦雯姝、关嘉琦和霍贵成*等人采用M17培养基为基础培养基，通过单因素试验确定其最佳的氮源和碳源，通过响应面法优化乳酸乳球菌KLDS4.0325的前体物质添加量及发酵条件，以期为该菌株的产业化应用提供一定的实践基础。
KLDS4.0325发酵液中的叶酸含量
1.1 叶酸标准曲线的绘制
根据1.3.1.2节色谱条件，以叶酸标样浓度为横坐标x， 峰面积为纵坐标y，得其回归方程为：y＝68 096x+941.37，R 2 ＝0.998。
1.2 乳酸乳球菌KLDS4.0325发酵上清液中叶酸的HPLC检测
如图1所示，质量浓度0.05 mg/mL的叶酸标准品的保留时间为10.272 min。菌株KLDS4.0325发酵上清液的液相色谱图在第10.271分钟处有峰，与标品的分析结果一致，可以定量。
单因素试验结果
2.1 碳源的影响
碳源是影响菌体代谢与生长的重要元素，不同碳源对乳酸乳球菌KLDS4.0325叶酸产量及生长量如图2所示。乳酸乳球菌KLDS4.0325可以利用多种碳源，方差分析结果显示不同种类的碳源对该菌株的叶酸产量和生长量均有显著影响（P＜0.05）。当以葡萄糖为碳源时，叶酸产量达到（0.382±0.032）μg/mL，显著高于其他其他碳源（P＜0.05）。从生长量看，以蔗糖为碳源时第24小时的OD600nm值显著高于其他源（P＜0.05），葡萄糖其次。由于不同碳源的结构不同，乳酸乳球菌KLDS4.0325产叶酸的最适碳源为葡萄糖。而生长的最适碳源为蔗糖，葡萄糖仅次于蔗糖，因此确定葡萄糖为乳酸乳球菌KLDS4.0325产叶酸的最佳碳源。
2.2 氮源的影响
不同氮源对乳酸乳球菌KLDS4.0325叶酸产量及生长量的影响结果显示，当以酵母浸粉为单一氮源时，乳酸乳球菌KLDS4.0325的叶酸产量和生长量均显著高于其他组别（P＜0.05）。从生长量来看，有机氮源比无机氮源更能促进该菌株的生长。
2.3 初始pH值的影响
结果显示，当培养基的初始pH值为5.2时，叶酸的产量最高，达到了（0.291±0.008）μg/mL，但与pH 6.2差异不显著（P＞0.05），与其他组有显著差异，并且对比于使用未优化的M17培养基的结果（0.260 μg/mL）有显著提高，所以确定pH 5.2为培养基最佳初始pH值，进行Box-Behnken试验。
在乳酸菌合成叶酸的通路中，需要多种关键酶的参与，如GTP环化水解酶I，二氢叶酸合成酶，二氢叶酸还原酶，叶酰聚谷氨酸合酶等，培养基的初始pH值可能是通过影响这些关键酶的活性，影响菌株合成叶酸的速率，进而影响菌株单位时间内的叶酸产量，同时培养基的初始pH值也会影响微生物的生长繁殖。
2.4 发酵时间的影响
结果显示，0～2 h乳酸乳球菌KLDS4.0325的叶酸产率最高。在对数生长期时，叶酸产量略有下降。进入稳定期后，叶酸产量不断积累，在第24小时达到最大值（0.260 μg/mL），而后略有下降。因此，在后续实验中，选择24 h为乳酸乳球菌KLDS4.0325的发酵时间。
2.5 发酵温度的影响
结果显示，菌株在36 ℃恒温发酵时，叶酸的产量最高（0.283±0.006）μg/mL，但与30 ℃时无显著差异（P＞0.05），与其他温度处理组具有显著差异，综合考虑，选择36 ℃为最佳发酵温度，进行Box-Behnken试验。
在后续实验中，通过响应面设计探究了初始pH值和温度对KLDS4.0325叶酸产量的影响的交互作用。
2.6 接种量的影响
结果显示，在接种量为1.0%、2.0%、4.0%、6.0%的4 组之间KLDS4.0325的叶酸产量均无显著差异（P＞0.05），因此，该因素不参与响应面优化试验。
2.7 pABA和谷氨酸添加量的影响
结果显示，加入适量的pABA显著提高了乳酸乳球菌KLDS4.0325的叶酸产量，当pABA添加量为 40.0 mg/L时，叶酸产量最高为（0.369±0.030）μg/mL，约是未添加pABA的1.42 倍，但与添加量为50.0mg/L时无显著差异（P＞0.05）。根据实验结果选择40.0 mg/L作为Box-Bohnken试验的中心点。
除了pABA外，环境中的谷氨酸也是合成叶酸及其衍生物的前体物质，结果显示，加入适量的谷氨酸可以提高乳酸乳球菌KLDS4.0325的叶酸产量，当谷氨酸添加量为6.0 g/L时，叶酸产量最高为（0.521±0.042）μg/mL，约是未添加谷氨酸的2 倍，但与添加量为4.0 g/L和8.0 g/L无显著差异（P＞0.05）。根据实验结果选择6.0g/L作为Box-Behnken试验的中心点。
Box-Behnken响应面试验结果
利用Design-Expert 8.0.6软件对发酵温度、初始pH值、pABA添加量、谷氨酸添加量设计4因素3水平的Box-Behnken试验，方差分析结果显示，所选择的回归模型的P＜0.05，表明整体模型对试验结果具有显著的影响，具有可信度；而失拟项P＝0.052 6＞0.05，失拟项检验不显著，说明未知因素对试验结果的影响较小，残差主要由随机误差引起，模型选择适当；该模型的相关系数R＝0.957 3，校正相关系数为0.914 5，信噪比15.452＞4，表明模型可信度很高。叶酸产量Y对初始pH值、pABA添加量、谷氨酸添加量、温度的多元二次回归方程为：
叶酸产量＝0.80+0.19A+0.025B+0.057C-0.16D+0.028AB+0.020AC-0.079AD+0.034BC-0.056BD-0.088CD-0.28A 2 -0.086B 2 -0.072C 2 -0.25D 2
响应面试验结果
由回归方程所做的响应面立体图与等高线图如图9所示，主要反映了初始pH值、pABA添加量、谷氨酸添加量以及温度之间的相互作用，通过方程可知，二次项系数为负值，表明方程具有最大值。利用Design-Expert 8.0.6分析计算，最优发酵条件为初始pH 5.35、pABA添加量41.50 mg/L、谷氨酸添加量6.30 g/L、温度35.40 ℃，此时模型预测KLDS4.0325的叶酸产量为0.851 μg/mL。
回归模型的验证结果
根据模型优化结果，根据实际条件，设置初始pH 5.40、pABA添加量42.0 mg/L、谷氨酸添加量6.30 g/L、温度35.40 ℃为发酵条件，对优化结果进行进一步的验证，实验重复3 次，取平均值。验证实验中KLDS4.0325叶酸产量的平均值为0.814 μg/mL，与预测值拟合度达95.65%，表明优化模型可靠。在最优发酵时间第24小时的细胞密度为2.13×109CFU/mL。
结 论
针对KLDS4.0325的叶酸产量，通过单因素试验，确定了M17培养基中的最佳碳源和氮源分别为葡萄糖和酵母浸粉，最佳发酵时间24 h，并筛选出了对KLDS4.0325的叶酸产量具有主要影响的4 个因素，初始pH值、pABA添加量、谷氨酸添加量和温度。利用响应面 Box-Behnken试验建立了二次多项式回归模型，最终确定发酵条件为初始pH5.40、pABA添加量42.0 mg/L、谷氨酸添加量6.30 g/L、温度35.40 ℃，在此条件下KLDS4.0325的叶酸产量（0.814 μg/mL）比优化前（0.260 μg/mL）提高了3.13 倍。
本文《响应面法优化乳酸乳球菌KLDS4.0325产叶酸的培养基成分及发酵条件》来源于《食品科学》2020年41卷6期123-130页，作者：焦雯姝，关嘉琦，史佳鹭，李柏良，陆婧婧，闫芬芬，李娜，占萌，霍贵成。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190318-210。
