抗体制备指南——免疫方案的选择

能被特异性免疫应答所识别的分子被称为抗原。然而不是所有的抗原都是免疫原。免疫原是指能引起体液免疫和细胞免疫的分子。一些小分子物质只有在和有活性的大分子载体结合时才能引起免疫应答。因此免疫原和抗原是两个既有区别又有联系的概念。能引起抗体应答的抗原必定是免疫原。

制备抗体的第一步就是选择合适的抗原做免疫原。选择的抗原及其质量关系到能否成功得到你需要的具有一定特异性和实用性的抗体。在诱导产生任何抗体前需要认真考虑所制备抗体的用途。选择合适的抗原能最大限度的诱导产生具有所需特异性的抗体。如果制备的抗体用于免疫印迹或免疫组化试验，那么它必须对线性抗原表位具有特异性从而能识别变性的蛋白质。相应的如果抗体是用来检测细胞表面的蛋白质，蛋白质的构象表位是首要思考的，那么制备的抗体应能够识别天然蛋白质。如果抗体用于潜在的临床治疗，那么它识别天然抗原的能力是不可少的。

第二步要考虑如何筛选所需的抗原。抗原来源的多样性使更多的免疫接种和筛选策略可供选择。这些抗原包括多肽、原核或真核重组蛋白、全细胞抗原、质粒DNA和腺病毒表达的抗原等。

人类基因组基因序列测定得到了很多潜在的抗原和核苷酸序列和蛋白质序列。可通过美国国家生物技术信息中心（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等公开的数据库进行搜索。这些数据库提供了丰富的信息来源，可用于识别和分析潜在的抗原。抗原作为潜在的免疫原的关键因素之一是确定了它与制备抗体所用物种间的亲缘关系。

对于任何特定的抗原应选择以下物种来制备抗体。抗原和这个物种的内源性同源体同源性应最小，以增加抗原的特异性，从而提高免疫原性。许多动物包括兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊、猴子和鸡等已被用于制备抗体。最常用的动物是兔子、小鼠、大鼠、因为它们易于饲养而且通常可产生良好的抗体应答。免疫家兔往往需要大量的免疫原，但是可产生大量的血清。大鼠和小鼠产生的血清量少，但可以用来制备单克隆抗体。

需要考虑的另一个因素是抗原和相关蛋白质及家属成员的潜在同源性，以减少生成的抗体和类似抗原发生不必要的交叉反应。HomoloGene是一种自动检测同源基因的计算机系统。它可以自动地在已经完成测序的真核生物之间同源基因。使用类似HomoloGene这样的系统可以分析内同源性和种间同源体，使设计的抗原达到最强的免疫原性和最弱的交叉反应。如果发现同源性氨基酸水平>90%的区域，需要使用免疫性最低区域对应的短蛋白片段或多肽。当制备功能性抗体的时候，可使用生物信息学来查明和确定所针对的特异性蛋白质结构域的功能。利用TMpred程序可以预测蛋白质跨膜区域蛋白质进行定位。这个程序主要依靠一个天然存在的跨膜数据库TMbaes,来确定细胞表面分子的跨膜拓扑模型，这样就可以识别胞外结构域，并以之为靶点来生成可用于流式细胞仪的抗体。PSORTII及其相关程序和数据及也可以预测亚细胞的定位

 二、多肽抗原

多肽无疑是生产抗原的最快方式，可用于免疫接种来制备抗体。这种方法可靠，经济，可在几周内提供高质量的多肽用于免疫接种。多肽可以特别有效的提高抗体与抗原某特定区域的特异性，如新的结构域或同源性最低的区域。很多情况下，重组蛋白因为不能被表达与纯化而不能作为抗原的来源。对于大分子跨膜蛋白，如G蛋白偶联受体来说是经发生的，对应胞外结构域蛋白环装结构的短肽已被证明是可行的免疫原，可以产生针对这些复杂分子的抗体。 

由6个氨基酸组成的肽可以用来制备抗血清，由10-12个氨基酸残基组成的多肽通常有更高的免疫原性。一个较短的抗原表位的例子是Flag标签，其在蛋白纯化、鉴定和功能分析领域被广泛使用。这是一个八肽序列（DYKDDDDK），其单克隆和多克隆抗体很容易买到。有12-15个氨基酸组成的多肽在多数情况下都是非常好的免疫原。由30-35个氨基酸组成的较长多肽，虽然本身化学合成受限，但也是非常好的免疫原，其优点是可能会形成相关的二级结构。多肽免疫原使用受限是因为其线性表位序列短，在一个完整的蛋白质抗原中不易被识别。因而多肽产生的抗体趋向于识别线性表位，总的来说，在免疫印迹实验和其识别变性蛋白的抗体试验中效果非常好。然而，由多肽产生的抗体通常不能识别蛋白质构象，因此不太可能和天然分子反应。这样的抗体往往没有功能，不能用于流式细胞仪。但是应该指出的是，在有些情况下多肽免疫原确实能够生成识别天然蛋白质的抗体。例如当蛋白质抗原的线性表位没有被其他的三级结构所掩盖的时候。

多肽抗原由于长度较短应被视为半抗原，需要结合载体蛋白以提高其免疫原性。对小于3KDa的多肽来说，这种结合被认为是有必要的；对于任何不超过10KDa的多肽来说，这种结合可能是有益的。典型的载体蛋白包括孔血蓝蛋白、牛血清蛋白和卵蛋白。载体和多肽结合物通过脱盐和透析的方法进行纯化，并分装冻存保存。初次免疫动物应该注射多肽和弗氏完全佐剂的复合物，初次加强免疫使用多肽和弗氏不完全佐剂的复合物，随后的加强免疫不需要佐剂。

多肽抗原的免疫进度表：

1、小鼠

BALB/c 雌性，6-8周龄

初次免疫：取50ug多肽和10ug弗氏完全佐剂，加磷酸盐缓冲液至液体总量200ul,腹腔注射；加强免疫（至少两次）：取50ug加10ug弗氏不完全佐剂，加PBS至总量200ul，每3-4周腹腔注射一次；最后一次免疫注射100ug多肽（静脉注射，不加佐剂），3-4d后取脾。 

2、家兔

新西兰白兔，雌性，8周龄

初次免疫：取0.4mg多肽加0.1mg胞壁酰二肽佐剂，加PBS至液体体积1ml，再加等量弗氏完全佐剂混合均匀乳化后，皮下两侧腹股沟和腋窝共四个点注射；4周后第一次加强免疫：取0.2mg多肽，加PBS至液体总量1ml,再加等量弗氏不完全佐剂乳化均匀后参照第一次免疫行第二次免疫；第二次和随后的加强免疫：取0.1mg多肽加入50-100ul PBS,无佐剂，静脉注射，4周一次；加强免疫后5~7d取血后可以得到20ml血清。 

由多肽产生的抗体应该在预先免疫后的加强免疫期间搜集血清进行检测。使用没有载体结合的多肽包被反应板做酶联免疫吸附实验，来区分是多肽还是载体引起的免疫应答。因此一定只能把部分多肽和载体结合而留一些多肽用于以上试验。 

三、蛋白质抗原

历史上，使用经典的蛋白质纯化化学方法已经可以从组织或细胞中分离蛋白质抗原，但是这种方法费事且高度专业化，而且往往蛋白质产量低，特异性差。近年来发展起来的重组蛋白技术能够相对简单地生产高质量的纯化蛋白，蛋白质的纯度很重要，因为它能取保任何特异性免疫应答是针对目的蛋白的，而不是针对免疫显性污染物。许多试剂，包括表达系统和试剂盒均可购买，蛋白质可以从很多异种来源，包括大肠杆菌、昆虫细胞、酵母和各种哺乳细胞等细胞培养系统得到。当选择适当的表达系统的时候，蛋白质的质量、生产速度和产量通常是最重要的考虑因素。使用原核表达系统成本低廉且耗时最少，但表达的蛋白质有时功能低下，而用真核系统表达的蛋白质更能保证蛋白质的功能。重组DNA技术实现了融合蛋白的构建，可在目的序列上添加特异性亲和标签。这些切合标签被用于亲和层析从而简化了重组融合蛋白的纯化过程。 

亲和标签包括Flag、c-myc、HA、GST、GFP和6X His。这些标签的抗体用于免疫印迹试验、流式细胞仪和免疫组化法检测融合蛋白，同时它们对融合蛋白功能的影响很小。带有Flag、MYC和HA标签的蛋白质融合需要结合有抗体的亲和层析柱，因此大规模纯化的费用昂贵。GST标签依靠其和覆盖谷胱甘肽基质既强大又可逆的亲和力，使大规模蛋白质纯化成为可能。但是GST标签本身有较高的免疫原性，可以诱导较强的免疫应答。GST可以和融合蛋白分离，但是这种分离是不完全的的，且费用昂贵。6X His以六个组氨酸残基螯合像镍这样的金属离子为基础，可以通过固定的镍柱亲和层析方法进行纯化。其纯化的规模可大可小，经济有效，可进一步完成，蛋白质在天然和变性的状态下都可以。His-tag相对说无免疫原性，这么小的分子通常不会影响融合蛋白的结构和生物学功能，所以对作为免疫原的蛋白质进行纯化，它是很好的标签。 

6X His标记重组抗原的表达与纯化

1、试剂准备

2、大肠杆菌小规模培养和蛋白质诱导

对某一特定蛋白质抗原来说，要进行小规模（100ml）的表达和纯化，应进行预实验来确定克隆、宿主和最佳的诱导时间。离心后分装的诱导细胞（10ml培养物）往往可以直接溶于样品缓冲液，如果有合适的抗标签抗体，就可以直接通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹试验确定最佳的培养条件并测定重组蛋白的溶解度。进行大规模制备前，要在优化条件下用镍亲和层析技术进行小规模纯化，下面描述的小规模柱纯化与用下述大型纯化系统进行100ml规模纯化相当。

• 接种含有重组质粒的大肠杆菌到20ml含抗生素的LB培养基（氨苄青霉素100ug/ml），37摄氏度剧烈震荡培养过夜。

• 按1:50的比例把过夜培养的细菌接种到1L的LB培养基(含抗生素)，37摄氏度剧烈振荡培养至OD600为0.6。

• 诱导前迅速取出1ml样品备用。

• 在培养液中加入IPTG诱导表达，至终浓度为1mol/L。

• 继续培养4-5h(根据预实验结果)，收集1ml样品备用

• 离心4000g,20min,收集细菌

• 细菌沉淀于-20摄氏度冷冻储存过夜。

• 在冰上融化细菌沉淀

• 每升诱导培养物加25ml超声缓冲液

• 在混合液中加1片完全蛋白酶抑制剂（Roche，Indianapolis，IN）和2mmol/L苯甲基磺酰氟

• 充分混匀沉淀

• 加溶菌酶0.5mg/ml

• 缓慢倒进玻璃烧杯，用搅拌棒在4摄氏度轻轻的搅拌30min

• 高频超声20SX8次（20W）,或French press 1100psiX2次（必要时超声20SX4次），冰浴

• 超声处理使黏度下降时，离心11000r/min，30min，4摄氏度

• 4摄氏度保存上清液和沉淀直至使用

上清液（可溶性蛋白质）处理

• 加咪唑至终浓度10mmol/L

• 用洗涤缓冲液平衡Ni++NTA树脂（Qiagen），离心，覆洗（0.5ml树脂/沉淀）。

• 用少量洗涤缓冲液冲洗混悬树脂，并加到上清液中，慢慢搅拌1h,4摄氏度。

• 准备空柱和缓冲液。用洗涤缓冲液清洗空柱

• 把上清液/镍树脂倒进柱里，收集流出的液体。

• 用20ml洗涤缓冲液洗柱，或直至吸光值返回基线。

• 用洗脱缓冲液洗脱，4mlX6次，或直至吸光值返回基线。

• 用含8mol/L尿素的洗脱缓冲液洗脱，4mlX3次

• 分装后4摄氏度保存（保留部分树脂进行凝胶电泳）。

超声波沉淀（包涵体）

• 把沉淀保存在-20摄氏度直到使用

• 用25ml0.5%CHAPS洗涤超声（15-20W）20S，清洗沉淀一次（或根据需要）

• 离心11000r/min,25min,重复4次或直至上清液澄清

• 用0.5%DOC清洗重复上述步骤3-5次

• 用pellet结合缓冲液混悬沉淀，如有必要可超声

• 用pellet结合缓冲液平衡Ni++NTA树脂（Qiagen），离心，覆洗（0.5ml树脂/沉淀）

• 把树脂加到混悬的沉淀中，室温搅拌45min

• 准备空柱和缓冲液。用pellet结合缓冲液清洗空柱。

• 把沉淀/镍树脂倒进柱里，收集流出的液体

• 用20mlpellet结合缓冲液洗柱

• 用20ml 0.5%DOC结合缓冲液洗柱

• 用20ml pellet洗涤缓冲液洗柱，或直至吸光值返回基线。

• 用pellet洗脱缓冲液#1洗脱，4mlX6次

• 用pellet洗脱缓冲液#2洗脱，4mlX3次

• 分装后4摄氏度保存（保留部分树脂进行凝胶电泳）。

备注：在纯化每一步通常都要保存部分样品进行SDS-PAGE.所有步骤的样品都应该做SDS-PAGE跟踪重组蛋白。如果有抗体，应当用western blot检测样品凝胶。从而确定重组蛋白在纯化过程中的纯度和复性情况。 

3.重组蛋白的免疫进度表

3.1 小鼠

BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄

初次免疫：取25-50ug蛋白质和10ug弗氏完全佐剂，加PBS至总体积0.2ml,腹腔注射：加强免疫：取等量蛋白质和10ug弗氏不完全佐剂或其他适合的佐剂，加PBS至总体积0.2ml，腹腔注射至少两次，相隔3-4周，最后一次加强免疫后3-4d取脾。 

3.2 家兔

加PBS至液体体积1ml，再加等量弗氏完全佐剂混合均匀乳化后，皮下两侧腹股沟和腋窝共四个点注射；4周后第一次加强免疫：取0.2mg蛋白，加PBS至液体总量1ml,再加等量弗氏不完全佐剂乳化均匀后参照第一次免疫行第二次免疫；第二次和随后的加强免疫：取0.1mg多肽加入50-100ul PBS,无佐剂，静脉注射，4周一次；加强免疫后5~7d取血后可以得到20ml血清。 

四、全细胞免疫原

对于通常表达在细胞表面的天然抗原，用全细胞抗原来制备抗体是很好的选择。就在细胞系中外源表达的膜蛋白而言，如果该细胞系来源于用于生产该抗体的物种，那么重组细胞中除了表达的重组抗原外，其他成分应该都无免疫原性。该细胞系能够对重组抗原进行翻译后修饰，使其像天然蛋白质一样，并将抗原的相关构象表位呈递与细胞表面 

因为载体pCEP4和pREP4含有巨细胞病毒或Rous肉瘤病毒的长末端重复序列增强子-启动子，所以其适用于高水平的组成型表达。这两类载体可以在灵长类动物细胞内进行游离基因的瞬时高表达。用线性载体进行转染和选择适当的药物可以产生稳定的表达细胞系。 

其他载体（pcDNA）适用于各种哺乳动物细胞的快速克隆和组成型表达，这些载体可以携带不同的选择性标记，带或不带融合蛋白标签，还可以具有其他特性，如表达分泌蛋白质或诱导型表达等。许多载体使用巨细胞病毒的增强子-启动子从而可以在哺乳动物细胞内高水平表达。如果巨细胞病毒的启动子对载体而言不是最佳选择，可选择人EF-1α或者Ubc启动子。 

不管选择哪种载体，表达的目的片段都应该使用标准的DNA重组技术经PCR扩增后克隆到载体上。如有可能，应该克隆全长基因，也应确保该基因能被适宜的转运到细胞表面进行翻译后修饰和正确折叠。此外，为了避免标签对蛋白质构象的潜在影响，蛋白质的附加标签应仅限于细胞的胞内区，但仍然提供表位以确保蛋白质被检测到。有些技术可以使表达载体稳定的转染到哺乳动物细胞中，包括磷酸钙沉淀法、电穿孔法、阳离子脂质体转染法和适当抗生素筛选表达稳定的细胞株。作为全细胞免疫原的细胞系在使用前，最好通过免疫印迹分析和流式细胞仪，证明其具有表达细胞表面蛋白的所有特性。细胞系建立后，应存放等分样品在液氮中，当培养物表达量有损失时可以作为替代品。 

全细胞免疫原的免疫方案

小鼠

BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄

完整细胞通常具有强免疫原性，无需要佐剂。把细胞用PBS洗涤三次后以适当的浓度悬浮于PBS。免疫小鼠的典型剂量时2X10^6--5X10^7个细胞，腹腔注射（0.4ml,10^8个细胞/ml）此外静脉注射已经被成功地使用（0.1ml,0^8个细胞/ml）间隔3——8周用类似的剂量进行加强免疫，最后一次免疫后2-4d取脾。

五、基因免疫

根据抗体疗法的最新进展要求，应该开发有效的方法来生成针对膜蛋白天然构象的抗体。这些蛋白质不容易被表达。其天坛构象也难维持。在任何重组蛋白不能被表达的情况下，可利用基因疫苗接种技术在小鼠或较大的动物内制备抗体

1 质粒DNA

用表达目的基因的质粒DNA免疫动物来制备抗体有明显的优势，因为不需要表达蛋白来产生免疫原。由于没有大肠杆菌或者哺乳细胞宿主细胞污染，质粒表达载体可诱导特异性高的体液免疫应答。通过使用截短的基因片段，添加分泌细胞序列和共表达辅助分子的方式可增强质粒DNA引起的体液免疫应答。这个技术还可以运用于将多个基因免疫同一动物，甚至是一个基因表达文库同时免疫同一动物而不会出现明显的抗原性竞争。

用质粒DNA免疫动物制备多克隆抗体或单克隆抗体的主要缺点是生成的抗体效价相对较低，有时甚至多次免疫后也是如此。与通常注射几十微克重组蛋白免疫原相比，这种结果和蛋白质体内低表达直接相关。这些多克隆抗体的低效价和制备单克隆抗体的杂交瘤细胞产量低相关。然而在某些情况下，质粒DNA还是具有优势的，而且有许多文献报道了成功利用质粒DNA免疫动物制备小鼠和兔的多克隆抗体以及小鼠的单克隆抗体，得到的抗体可以结合多种抗原的构象表位和线性表位 

1.1 表达载体构建请咨询爱康得生物 

1.2 小鼠

BALB/c 小鼠，雌性，6-8周龄

剂量：每次100ug

免疫途径和用量：一种方法是在小鼠每个后腿胫骨前（胫）肌肉进行肌肉注射50ul(用结核菌素注射器和28号针头)，总量为100ul。另外的一种方法是在小鼠尾巴底部皮内注射100ul。皮下注射DNA无效。

方案：免疫4次，每次间隔不少于10d，每3周一次最佳。每次免疫接种前需监测血清抗体的效价。最后一次免疫接种后3-4d取脾以制备杂交瘤细胞。 

1.3家兔

新西兰白兔，雌性，8周龄。

剂量：1mg/次

免疫途径和用量：在家兔每个后腿股四头肌肌肉注射200ul或在背部减去被毛的多个部位皮内注射，每个部位100ul，直至达到总量为止。

方案：免疫接种至少4次，必要时可以更多，每月一次。每次接种后3周取血来监测血清抗体的效价。

1.4  提高DNA免疫的效率

以下方法的一些精细调整手段可以用来增加DNA免疫的效率

• 在巨细胞病毒增强子/启动子的下游添加巨细胞病毒，即可早期基因内含子A元件可显著提高质粒载体的蛋白质表达水平。

• 据报道，在目的基因的上游增加分泌信号序列，在体内可以显著增加抗体的应答水平。

• 使用基因枪粒子轰击装置导入质粒可以提高质粒在体内细胞的导入效率，例如使用Helios基因枪。与肌肉或皮肤注射引起的抗体应答所需的DNA量相比，使用基因枪仅需要少于其100倍的DNA即可达到同样的抗体应答效果。

• 通过针注射法或基因枪接种法把DNA直接导入细胞脾细胞的技术，已被用来提高呈表达蛋白给B细胞的效率。使用这种技术免疫小鼠仅需一次就可制备多克隆抗体和单克隆抗体。搜集脾细胞制备杂交瘤细胞的最佳时间是经脾免疫后5d，这时IgM和IgG同种型抗体正在生成。是一个非常快速的免疫方案。

• 最后增加佐剂，如同注射编码粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子治疗，或质粒DNA吸附明矾，可以提高体内抗基因产物抗体的效价。 

1.5 抗体应答

使用DNA免疫小鼠和家兔得到的抗体效价为1/100000~1/10000,小鼠体内产生的抗体通常是混合的IgG亚类，以IgG2a为主。然而，多克隆抗体的总效价和抗体亚类之间的平衡受很多因素的影响，如抗体本身因素、导入的方法、小鼠品系、分泌信号序列的存在于缺失等。使用这种免疫方法，可以生成IgM、IgG1和IgG2a同种型的单克隆抗体，这些抗体与使用佐剂的蛋白质免疫原或使用病毒载体制备的抗体的亲和力相似。 

1.6 使用其他免疫原加强DNA免疫

如前所述，单独DNA免疫动物制备的多克隆抗体效价较低，生成杂交瘤细胞的效率低。在这种情况下，使用第二种免疫原加强免疫可增强抗体应答，如表达抗原蛋白的细胞或重组病毒载体。这种策略不仅提高了总抗体效价，但似乎同时也能激活B细胞，从而提高了稳定杂交瘤细胞的产量。这种加强免疫方法保留了抗原的天然结构，而不需要表达重组蛋白。这种方法特别之处是DNA能够激发针对目的基因的体液免疫，而不是针对加强免疫所使用的任何宿主细胞蛋白或病毒蛋白。 

2 腺病毒

如同质粒表达载体一样，如果要制备细胞表面蛋白质或其他构象蛋白质的抗体，使用腺病毒载体进行免疫接种具有特别的优势。制备重组腺病毒比构建重组质粒更为复杂，但总的来说，因为重组腺病毒在体内表达更大量的蛋白质，所以诱导的抗体效价更高。如前所述，重组腺病毒质粒可作为唯一的免疫原，或者与DNA联合应用启动免疫。 

2.1 重组腺病毒载体的构建，详情请咨询爱康得生物

2.2 腺病毒的纯化和滴度测定，详情请咨询爱康得生物 

2.3 腺病毒的免疫接种

由于没有E1基因，这些重组腺病毒不能在免疫接种的动物体内进行复制，也不会产生子代颗粒。然而，无论是实验室还是动物室使用的材料，都应在II级生物标准的条件下处理。如用于免疫接种使用“空斑形成单位/ml”(pfu/ml)来定量更合适。 

2.4 小鼠免疫

BALB/c 雌性，6-8周龄。

剂量：最佳剂量将随着特异性抗原不同而不同，但给每只小鼠接种10^6~10^8pfu(以适宜的浓度溶于PBS)来测试免疫反应是合理的。在接种前，解冻的腺病毒应冰浴保持。

免疫途径和用量：在小鼠每个后腿胫骨前肌肌肉注射50ul(用结核菌素和28号针头)，总剂量为100ul。另外一种方法是在小鼠尾巴底部皮内注射100ul。用腺病毒免疫接种时，和皮下注射相比，肌肉注射和皮内注射可以引起更强有力的抗体应答。

方案：免疫2次，间隔3周。因为动物体内诱导了病毒中和抗体，，进一步的免疫接种不会增强反应强度。最后一次免疫接种后3-4d取脾脏制备杂交瘤细胞。 

2.5 家兔

新西兰白兔，雌性，8周龄

剂量：10^7~10^9pfu，用PBS稀释至适当浓度，在接种前，解冻的腺病毒应冰浴保存。

免疫途径浴用量：在家兔每个后腿股四头肌肌肉注射200ul或在皮肤减去被毛的多个部位注射，每个部位10ul，直至达到总量为止。

方案：免疫2次，间隔3周。因为动物体内诱导了病毒中和抗，进一步的免疫接种不会增强反应强度。