DPP-4又称T细胞表面抗原CD26，是广泛存在于细胞膜上的一类具有潜在的调节免疫、内分泌以及神经系统等功能的膜结合丝氨酸蛋白酶，其存在于多种器官中且家族成员众多，在肠道中高表达，于肝脏、胰腺、胎盘、胸腺等处也有表达，部分以可溶形式存在于循环血液中。目前市场上DPP-4抑制剂类药物多为列汀类，但是据一些药物上市后的检测结果显示，西格列汀可引起严重的过敏反应以及出血性或坏死性急性胰腺炎；维格列汀有肝毒性报道。因此，列汀类DPP-4抑制剂的长期安全性仍然需要更多的临床研究来评价。寻找天然来源的DPP-4抑制剂被提上日程。
乳酸菌作为定居肠道中的有益菌群具有多种生理功能，如缓解乳糖不耐受症、改善便秘和腹泻、维持肠道微生态平衡和肠管机能、增强免疫功能和抗肿瘤、影响心血管疾病的发展、缓解过敏反应等。近年来，一些研究报道乳酸菌还具有抑制DPP-4和α-葡萄糖苷酶的作用，因而已经成为控制糖尿病、缓解高血糖和增加胰岛素敏感性的潜在新型和天然治疗药物。山西农业大学食品科学与工程学院的董杰、朱俊玲*和中国农业科学院农产品加工研究所的吕加平*等人的目的是筛选出1 株对DPP-4有良好抑制作用的乳酸菌，并用多种方法对乳酸菌的代谢物进行分离纯化，最终鉴定出乳酸菌代谢物中抑制DPP-4的主要物质，为以后实施代谢调控提供理论基础和参考。
1. CFS和CFE对DPP-4的抑制力
结果显示，阳性对照组对DPP-4的抑制率最高，为32.33%；除菌株1.6970外，其余菌株的CFE均对DPP-4有较弱的抑制作用，抑制活性最强的为菌株1.1881，但抑制活性仅为9.5%左右。6 株菌株的CFS对DPP-4均具有抑制活性，而且除菌株1.6970外其余菌株的CFS抑制率都比其CFE的抑制率高；其中植物乳杆菌BLP12的抑制率最高，抑制率为27%左右，其次是ST-2；对于菌株1.6970不论是CFS还是CFE其抑制率都是最低的，所以选择其作为抑制活性最高菌株BLP12的对照菌株。本实验所选菌株的CFS中具有良好的DPP-4抑制能力；而CFE中不含或含有极少的该类抑制物，所以选取BLP12的CFS做下一步的研究。
2. 不同萃取溶剂CFS萃取物对DPP-4抑制活性的影响
从图1可以看出，对于植物乳杆菌1.6970，本实验所选用的有机溶剂的萃取液对DPP-4均有抑制活性，其中甲醇、丙酮、乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性较高，而且均高于原液；石油醚萃取液水相部分和有机相部分、乙酸乙酯萃取液有机相部分的抑制活性低于原液，石油醚萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最弱，抑制率仅有3%左右；对于植物乳杆菌BLP12，除石油醚外其他有机溶剂的萃取液对DPP-4均有抑制作用，其中乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最高，显著高于原液，抑制率高达50%左右；其次是丙酮萃取液，抑制率为27%左右；甲醇、乙酸乙酯萃取液有机相部分的抑制活性均低于原液；石油醚萃取液对DPP-4没有抑制作用，反而有促进作用。
通过图1可以看出，植物乳杆菌BLP12的乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最高，所以最终选择乙酸乙酯作为萃取剂。
3. CFS萃取液的分级分离及其分离组分的DPP-4抑制活性
结果显示，样品经过不同分子质量的分级后，所得部分的抑制率均有所下降。植物乳杆菌1.6970不同分子质量大小的CFS对DPP-4均具有抑制活性，其中分子质量小于5 kDa的样品抑制活性最强，分子质量大于10 kDa和5～10 kDa的样品的抑制活性较弱，因此推测具有DPP-4抑制作用的物质分子质量小于5 kDa。
植物乳杆菌BLP12不同分子质量大小的CFS对DPP-4均具有抑制活性，而且均比1.6970的抑制活性高；分子质量小于5 kDa的CFS的抑制活性远大于分子质量5～10kDa，因此，推测植物乳杆菌BLP12的CFS中抑制DPP-4的活性物质主要为小于5 kDa的物质。
将超滤后分子质量小于5 kDa的溶液进行收集，并利用Superdex peptide层析柱对样品进行进一步分离纯化。从图3可以看出，植物乳杆菌1.6970分出9 个组分，BLP12分出10 个组分，对每个组分进行收集，并标记1.6970的9 个组分为A-1～A-9，BLP12的10 个组分为B-1～B-10。测定各个组分的DPP-4抑制活性。
结果显示，植物乳杆菌1.6970的所有组分对DPP-4均具有抑制活性，但抑制活性都较弱，其中抑制活性较高的有A-4，经过2 次柱子的稀释后仍具有14%抑制率。对于BLP12菌株，收集到的10 个组分均具有抑制活性，且每个组分的抑制活性都较高，其中组分B-5的抑制活性最高，抑制率高达46%，比原液的抑制率高19%；其次是组分B-9，抑制率为37%。所以最终选择植物乳杆菌BLP12的组分B-5和组分B-9进行下一步的分离纯化。
将样品B-5和B-9用半制备高效液相色谱进行进一步分分离纯化，如图5所示，B-5分离出4 个组分，分别记为B-5-1、B-5-2、B-5-3、B-5-4；B-9分离出2 个组分，分别记为B-9-1和B-9-2。对分离得到各个组分进行收集并测定对DPP-4的抑制率，以便选择最终进行质谱鉴定的样品。
结果显示，组分B-9-1的抑制活性很低，组分B-9-2没有抑制活性；B-5经分离得到的4 个组分除B-5-4外，其余组分都有较弱的抑制活性，B-5-3的抑制活性最高，抑制率为8%左右。尽管组分B-5-3的抑制活性最高，但是由于样品经过多次分离纯化，已经被稀释很多倍，样品中可以抑制DPP-4的活性物质含量已十分稀少，所以在进行下一步的质谱鉴定前，将样品用冷冻浓缩机进行浓缩。
4. 质谱鉴定结果
植物乳杆菌BLP12的细胞代谢物经分离纯化后用高效液相色谱-质谱联用仪鉴定代谢物中的物质种类，共鉴定出61 种物质。
讨论与结论
本研究测定6 株益生菌的细胞代谢物和细胞内容物的DPP-4抑制作用，结果显示植物乳杆菌BLP12的细胞代谢物对DPP-4的抑制效果最为显著，将BLP12的代谢物进行分离纯化并用高效液相色谱-质谱联用仪检测样品中物质种类，最终得到61 种物质，经查证其中11 种物质与治疗糖尿病相关，其中有4 种DPP-4抑制剂，其余7 种与治疗糖尿病相关物质。这11 种物质分别是十二烷基硫酸盐、烟酸、环(苯丙氨酸-脯氨酸)、亮氨酸脯氨酸、十二烷二酸、吡啶羧酸、十八碳三烯酸、别嘌呤醇、鸟嘌呤、邻苯三酚、曲酸。
从植物乳杆菌BLP12的代谢物中分离出的这些物质充分说明，植物乳杆菌不仅具有抑制DPP-4的作用，还可以通过其他多种方式改善糖尿病的症状。
本文《乳酸菌代谢物中二肽基肽酶-4抑制剂的分离纯化及鉴定》来源于《食品科学》2020年41卷8期116-122页，作者：董杰，刘鹭，甲承立，朱俊玲，吕加平。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190411-138。
