生物表面活性剂通常由酶法合成或微生物代谢产生,与化学合成的表面活性剂相比有很多优点,如毒性低,生物可降解,且对环境友好,因此受到人们的广泛关注.由微生物代谢产生的表面活性剂有很多种,可分为两大类,即低分子量表面活性剂和大分子聚合物,前者包括糖脂和脂肽,如鼠李糖脂、海藻糖脂、槐糖脂及脂肽、短杆菌肽等,后者如聚糖脂、聚蛋白脂等.由于微生物产生的表面活性剂结构及表面性质有很大差异,在食品、医药、石油、化工和环境修复等方面得到了不同的应用[1～4].槐糖脂是一类重要的生物表面活性剂,近年来受到了人们的广泛关注.最近,欧美及韩国一些学者经研究发现,槐糖脂具有一定的抑菌作用,并且能够刺激皮肤表皮细胞和真皮成纤维细胞的生长[5～8].这些研究对槐糖脂的有效应用具有非常重要的意义.本实验室筛选到1株能产生槐糖脂的拟威克酵母WickerhamielladomercqiaeY2A,我们对其产槐糖脂的发酵条件进行了初步研究.
1 材料和方法
1.1 菌种拟威克酵母W.domercqiaeY2A,本实验室筛选并保藏.
1.2 仪器和试剂
本研究所用试剂为分析纯和色谱纯,植物油为食用级.722光栅分光光度计(上海第三仪器厂),HZQ Q全温振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司),恒温培养箱(上海第三仪器厂).
1.3 培养基菌种保藏及种子培养基
YEPD培养基(ρ/gL-1):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母粉10,琼脂粉20(液体种子培养时不加).
发酵基本培养基(ρ/gL-1):KH2PO4 1,Na2HPO4·12H2O 1,MgSO4·7H2O 0.5(其他成分在优化培养时注明).
1.4 培养方法
1.4.1 液体种子培养
于300mL三角瓶装50mL种子培养基,接种一环已活化的斜面种子,160r/min,30℃培养24h.
1.4.2 摇瓶培养
于300mL三角瓶装50mL发酵培养基,按5%(φ)接种量接入液体种子,160r/min,30℃培养96h.测定发酵液槐糖脂含量及菌体浓度.
1.5 检测方法
1.5.1 槐糖脂含量的测定[9,10]
取发酵液加入等量乙酸乙酯,混匀后静置5min,5000r/m离心5min,加入具塞试管中,水浴蒸发掉乙酸乙酯,正己烷洗涤,蒸干,用蒽酮法测定.
1.5.2 菌体浓度的测定
取5mL发酵液,加入2mL正丁醇/乙醇/氯仿(V/V/V,10/10/1),混匀,5000r/min离心10min,蒸馏水洗涤2遍,干燥,称重.培养基不含植物油时以D600nm表示.
1.5.3 葡萄糖浓度的测定
DNS法.
2 结果
2.1 产槐糖脂培养基的优化
2.1.1 葡萄糖初始浓度对槐糖脂产生的影响
按1.4培养方法进行试验,以葡萄糖为碳源,0.4%(NH4)2SO4为氮源,初始pH6.5,培养96h.结果如图1所示,在3%～12%的葡萄糖浓度范围内,槐糖脂产量随其浓度的增大而增加,大于12%后出现下降的趋势,在12%时出现最大值;而菌体浓度在葡萄糖浓度3%～7%范围内,呈上升趋势,大于7%后呈下降趋势.推测葡萄糖浓度在7%时,满足菌体生长的要求,继续增加则产生底物抑制作用.
2.1.2 不同碳源对槐糖脂产生的影响
根据图1结果,在发酵基本培养基中分别加入12%葡萄糖,6%葡萄糖和6%(φ)葵花子油,6%葡萄糖和6%(φ)豆油,6%葡萄糖和6%(φ)菜子油,6%葡萄糖和6%(φ)玉米油,使混合碳源浓度基本达到12%,0.4%(NH4)2SO4为氮源,初始pH6.5,培养96h,结果如表1所示.可以看出,以6%葡萄糖和6%菜子油作碳源时,菌体干重8.0gL-1,槐糖脂产量可以达到3.6gL-1,均高于其他碳源,故选用葡萄糖和菜子油作复合碳源.
2.1.3 不同氮源对槐糖脂产生的影响
碳源确定后,在发酵基本培养基中再添加浓度为0.4%的不同的有机和无机氮源.结果如表2所示,有机氮源比无机氮源更有利于槐糖脂产生,以酵母粉为最好;对菌体生长来说,氯化铵和蛋白胨最好,尿素和酵母粉次之,硫酸铵最差.因此,确定酵母粉为最佳氮源.
2.1.4 培养基组成正交实验
选取葡萄糖、菜子油和酵母粉3个因子,采用5因素4水平的正交表L16(4 5)设计实验[13],得出产槐糖脂最优培养基配方.优化条件的因素水平见表3,具体结果见表4.
A:葡萄糖Glucose(w/%);B:菜子油Rapeseedoil(w/%);C:酵母粉Yeastextract(w/%).下同The same below
通过正交分析结果可以得知,对槐糖脂产量的影响因子依次排序为:B(菜子油)>A(葡萄糖)>C(酵母粉).综合考虑各因素对槐糖脂产量的影响,得出最优化组合为B4A4C3,即葡萄糖8%,菜子油8%,酵母粉0.3%.
2.2 摇瓶发酵条件的优化
2.2.1 初始pH对槐糖脂产生的影响
将培养基的初始pH调至pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0,培养后测定发酵液pH、槐糖脂产量及菌体浓度,结果如图2所示,pH为6.0时槐糖脂产量最高,而菌体浓度和终止pH没有明显变化,因此pH6.0为最优初始pH.
2.2.2 接种量对槐糖脂产生的影响
以1.0%、2.5%、5%、7.5%(φ)接种量进行发酵,结果如图3,表明2.5%的接种量最适宜.
2.2.3 发酵时间曲线
在以上优化的条件下,分别在不同的培养时间取样,测定葡萄糖消耗、槐糖脂产生、菌体生长及pH随时间的变化.从图4的结果可以看出,培养至120h时,葡萄糖浓度已降到非常低,几乎全部消耗;而该时间内槐糖脂含量一直处于上升趋势,与葡萄糖消耗呈负相关,继续培养槐糖脂产量没有显著增加;48h时,菌体生长进入稳定期;pH在0～48h内快速下降,从pH5.16下降到pH3.09,而在槐糖脂快速产生阶段,pH在pH2.9左右波动.
3 讨论
影响槐糖脂产量的因素有很多,如菌株、培养基组成、发酵条件等.其中碳源的种类不仅影响槐糖脂产量,同时也影响槐糖脂的组成.Candidabombicola、C.apicola等在槐糖脂产生过程中,第二碳源如植物油、脂肪酸、烷烃是否添加及添加的浓度都影响着槐糖脂的组成和产量[14,15].控制培养基中酵母粉的浓度也是提高槐糖脂产量的重要因素[16].在本研究中,葡萄糖和菜子油作为复合碳源,酵母粉为氮源,槐糖脂产量从优化前的3.6gL-1提高到41.3gL-1,实验结果与上述报道一致;并且该菌株与其他菌株相比,其发酵培养基组成和发酵条件更为简单,菜籽油作为主要底物价格低廉.本实验室筛到的Y2A拟威克酵母是首次报道的有自主知识产权的产槐糖脂新菌株,通过发酵条件优化使槐糖脂产量有了较大提高,利用补料发酵等技术进一步提高槐糖脂产量的工作正在进行中.
