( 1.英国利兹大学生物化学与分子生物学系分子免疫学研究室LS2 9 JT, U K； 2.重庆医科大学 医学检验 系 ，重庆 400046)
双歧杆菌是人和动物肠道的优势菌群 ,是维持宿主健康最重要的细菌。母乳喂养的婴儿比奶瓶喂养者具有更多的双歧杆菌 ，对腹泻肠道感染的易感性更低。在老年人双歧杆菌数量减少，而梭菌数量增加。双歧杆菌是革兰阳性、厌氧、无动力、无芽胞的杆菌 ，呈Y或 V形。传统的 ，双歧杆菌被看作乳酸菌 (lactic acid bacteria ， LAB)的成员 ，但其发酵糖类的主要终产物为乙酸：乳酸 3∶ 2。DN A中G+ C的摩尔百分比为55%～64% 。根据DNA- DNA杂交和糖发酵试验，目前双歧杆菌属有32个种。因双歧杆菌的有益作用，常被选做益生菌 ( probiotic)。益生菌最新定义( Guarner, 1998)为：摄入宿主后能产生超过固有基础营养价值的有益作用的活菌制剂。双歧杆菌作为益生菌定植于宿主胃肠道产生的有益作用包括： (1)维持健康的正常菌群； (2)通过产生细菌素和降低PH抑制病原菌生长； (3)改善乳糖耐受； (4)减少血清胆固醇； (5)减少血氨浓度 ； (6)产生维生素； (7)刺激免疫系统 ； (8)具有抗癌变和抗诱变活性。本文仅介绍双歧杆菌的免疫调节作用及其相关领域的研究进展。
1 双歧杆菌黏附作用的机理
双歧杆菌对肠道上皮和黏液的黏附作用和对免疫系统 的刺激密切相关 ,对肠粘膜的粘附也是短暂定植的关键 ，是 控制肠道微生物群平衡的前提。 肠黏液具有双重作用：它保护肠粘膜不与病原微生物接触 ，为正常菌群的定植提供最初的结合点、营养来源和增殖的介质 ；黏液可抑制细菌粘附上皮。黏液具有与上皮细胞相似的受体。细菌借以粘附后就不能达到肠细胞。 黏液被不断剥离进入肠腔 ，代之以杯状细胞新分泌的黏液。连续的黏液降解可解释许多益生菌为何只能短暂定植。 若细胞的增值超过黏液层的转换和剥离 ，则可大量定植。 要得到有关肠道微生态系统中细菌粘附行为的信息 ，新近的方法是研究选择菌株的表面特性。 微生物对自然环境的粘附可借研究细菌的表面特性来推断。这一过程包括研究细菌在烃-水界面的分配、电位、结合固体表面、凝集颗粒和粘附培养细胞单层的能力。
1.1细菌表面的理化特性
1.1.1疏水性检测细菌表面的疏水性源于菌体表面净电荷、极性和非极性残基的相对分布。 非极性残基增强细菌对非极性溶剂的亲和力，该残基暴露越多，对溶剂的亲和力越强。有几种方法检测细菌粘附到非极性介质和细胞表面的疏水性。尽管尚无某一种方法能满足所有要求 ,但其中一些方法可用于筛选大量的菌株。以对二甲苯或正十六烷的分配可达此目的。当细菌悬液与一定体积的二甲苯或十六烷混匀 后 ，细菌粘附在液滴表面 ，形成由细菌包被烃滴组成的奶油 状上层。溶剂的分配可经测定混匀后在水相中的液体浊度来 定量。 细菌在两种溶剂中的相对量是其疏水性的一个指数。 疏水性指数可表达为 H% = [( A0 - A ) /A0 ]× 100,其中 A0 和 A 分别是与溶剂混匀前后 600 nm的吸光度。高疏水性菌 株借此法可区别于低疏水性菌株。 Bibilo ni等用此法测定4株双歧杆菌的H%达90以上 ，而1株短双歧杆菌和1株婴儿双歧杆菌的H%分别为4.3和3.3。因细菌对烃的粘附与时间有关，所以推荐采用动力学方法 ,即与不同体积烃的粘附用时间来测量。在此疏水性用去除系数 ( remov al coefficie nt )来表达。细菌粘附烃的这种动力学测定法更适合于区别具有相近的高疏水性双歧杆菌菌株。单一点疏水性测定与动力学测定具有良好的相关性。Bibiloni 等测定的CID- CA531双歧杆菌用单一点测定具有高疏水性 但与其它高疏水性菌株相比较，具有低去除系数。当设计一种研究细菌表面的策略时 ，应仔细将方法标准化。应报告悬浮细菌的缓冲液 ，因离子强度和PH会影响测定结果。测定的温度和细菌在恒定电场的生长条件也非常重要。不同实验室间进行比较时，应采用具有不同粘附特性的参考菌株。
1.1.2 电位和电泳迁移率 电位是一种反映细菌表面净电荷分布的电位。 其定义为： 细菌表面与细菌在恒定电场下移动的液相剪切面之间的电位。电位可通过测定细菌在恒定电场的电泳迁移率来计算。培养基的粘度、p H和离子强度不同可影响总迁移率 ，故应标准化。电泳迁移率测定是将细菌悬液放置于具有Pt或Ag /AgCl电极的H形毛细管内 ，将电极外接直流电源。方法是：(1)校准： 在H形池内充以0.01mol / L NaCl, pH7. 4, 1mmol /L HEPES缓冲液配制的磷脂酰丝氨酸脂质体悬液，固定光学结构。设定磷脂酰丝氨酸脂质体的电位为 120 mV。光学结构经这样校准后应保持不变。用水彻底清洗。( 2)用1mmo l / L KCl细菌悬液替换磷脂酰丝 氨酸脂质体悬液。( 3)将电极与直流电源联接 ，固定电压为40 V。( 4)选择单个细菌，沿着光学平面内的分级网格均匀、直线地移动。(5)计算每单位时间替换的正方形数。(6)交替改变电极的极性，重复测定至少10次。(7)用相同样品的不同细菌重复测定直至得到可重复的结果。(8)计算细菌迁移率为细菌运动速度(每单位时间替换的正方形数)与所加电压的比率。用 Helmholtz-Smo luch ow ski方程计算电位。在所有情况下，温度为 25℃。常数可从有关手册查阅。通过用细菌悬液测定的变异系数为2%～5% 。建议所有溶液用 Milli- Q纯水配制。Bibilo ni等测得两株双歧双歧杆菌的电位均值分别为 -38. 2、-34. 9、 -35. 4和-30. 6 mV ， 1株短双歧杆菌的电位均值为-33. 0 mV, 1株婴儿双歧杆菌的电位均值为 - 24. 6 mV。
1.2细菌-细菌和细菌 -红细胞凝集
1.2.1自凝集 有些双歧杆菌的菌株具有粘附在玻璃管上生长，在液体培养基中形成凝集或团块的倾向。用光学或电子显微镜观察发现这些团块通常是由大的细菌簇形成。如果将细菌培养物混匀后放置不搅动，一段时间后，凝集细菌可与不凝集细菌区别开来。因为前者沉降使培养基澄清 ,而后者大部分持续呈弥散状。这些团块经激烈震荡或用缓冲液洗涤后相对稳定 ，但用去垢剂洗涤可被破坏。自凝集菌株之间的差异可用凝集指数(或自凝指数 ， a utoag g rega tio n index ， AI)和自凝时间( autoa gg reg ation time, AT)来衡量。AI定义为： 在均匀培养物中细菌的密度(每毫升毫克干重)和600 nm 的吸光度( A600 )之间的比率。测定方法： (1)将双歧杆菌厌氧培养于37℃MRS 24h或TPY 48 h。(2)混匀培养物，立即读取600 nm的吸光度( A600 )。必要时用培养基稀释样品。(3)精确测量一定体积的相同培养物，于10000 g ， 4℃离心10 min，以PBS洗2次。第3次用蒸馏水洗涤。在100℃干燥沉淀至恒重。计算每毫升毫克干重。( 4)计算AI=干重/A600。Bibiloni等测得 4株双歧杆菌的AI均值分别为 0. 64、0. 58、0. 78、0. 48, 1株短双歧杆菌和1株婴儿双歧杆菌的AI均值分别为0. 40和0.32。自动沉降的细菌悬液浊度的改变可用时间功能来测量。沉降的相对改变Arel可如下计算： Arel= ( A-Ai) /( Asat-Ai)，其中A是在某一时间的浊度， Ai是样品的起始浊度， Asat是在长时间获得的饱和浊度。Arel值可作为时间功能对各种稀释度细菌描点得出曲线。在超过特定稀释度的所有曲线都重叠 ，在该点可通过作图获得AT。AT定义为： 在任何稀释度的相对吸光度( Arel)达到50%饱和值的时间。测定方法： (1)生长和收获细菌如前。将600 nm的吸光度调至1. 0～2. 0。(2)在比色杯中悬浮菌悬液，在20 min 内以一定时间间隔评价浊度的时间过程 ，直到没有变化为止。(3)以系列稀释的细菌悬液重复此过程。(4)用以上公式计算Arel,描绘点Arel作为每一个稀释度的时间功能。(5)外推由Asat确定的直线，确定Asat /2。利用那些沉降与稀释度无关的曲线，找出相应的AT。细菌的沉降率取决于起始密度、悬浮介质、温度和细菌表面组成。非自凝菌株在任何培养基生长都表现为相同的表型。相反 ，自凝菌株在TPY培养基生长时清楚的表现出这种表型 ，而在M RS培养基生长却无此表型。由此 ， TPY培养基被推荐用于这类检测。AT可用于确定自凝菌株中自凝能力的强弱。 Bibilo ni等测得4株两歧双歧杆菌的AT值分别为8、8、12、3 min, 1株短双歧杆菌和1株婴儿双歧杆菌的AT均大于20 min。
1.2.2血凝 红细胞具有许多细菌粘附素的外部结构域 , 是测定细菌表面特性的一种方便细胞来源。若用完整菌细胞得到阳性血凝 ( hemagg lutinatio n, HA) ，大多数细菌的粘附素可作为血凝素来测定。在许多情况下 ，红细胞上为细菌粘附素暴露以外的位点也是在肠上皮细胞上表达的抗原。因此 ， HA是预测细菌与肠细胞相互作用的一个有力的试验系统。按Per ez等建立的方法： 将双歧杆菌厌氧培养与37℃TPY培养基48 h 14 000g 离 心 1 min, 50 mmo l / L pH K2 HPO4洗两次，调整菌浓度至1 mg /ml。在测定时使用U- 形微孔板非常重要。在没有HA时红细胞能沉降到孔底。用PBS倍比稀释菌悬液 ，每孔 25μl,加等量 2% 红细胞 ，放室温1 h,一定用光学显微镜检查 HA。当HA发生时 ，红细胞和细菌形成弥散的块状细胞网覆盖整孔。双歧杆菌不同菌株的 HA活性是不同的，一些菌株即使在低密度仍凝集红细胞，而另一些菌株根本不凝。Bibilo ni等测定的4株两歧双歧杆 菌均能凝集红细胞 ，而测试的短双歧杆菌和婴儿双歧杆菌均为 HA阴性。
1.3 粘附聚苯乙烯固体表面细菌粘附到一个表面是定植 的第一步。形成团块的菌株也可粘附在容器壁上生长。因此 定量测定粘附玻璃或聚苯乙烯的能力可用于确定双歧杆菌 的特性。 细菌粘附固体表面可用多种方法定量测定 ,如光学 显微镜、染色、放射性标记、 ELISA、生物发光、酶活性等。 方 法是将 500 ml( A600调至 1. 0～ 2. 0)细菌悬液加入 24孔组织 培养板 ，放 37℃ 1 h,用 PBS洗 3次去除非粘附细菌 ，用结晶 紫染色或测定 6-磷酸果糖磷酸转酮酶 ( fr ucto se 6-pho sphate pho sphoketo lase, F6PPK)活性定量粘附细菌。 F6PPK是双 歧杆菌发酵途径的一个关键酶。 F6PPK活性测定是定量测 定双歧杆菌的一个特异方法。 F6PPK将 6-磷酸果糖裂解成 乙酰磷酸和 4磷酸赤藓糖。酸酐的酰基部分被羟胺转化成氧 肟酸 ，后者与 3价铁形成亮紫色复合物 ，可在 500 nm分光光 度定量测定。 在反应混合物中加入 Trito n X-100可促进显 色 ，有利于定量测定低浓度细菌。 F6PPK方法可检测少至 0. 05 mg的双歧杆菌。对多数测定的菌株就每毫克吸光度来 说 ，至 1 mg呈线性关系 ，细菌浓度更高时应作稀释以更好地 定量。 由于在不同菌株特异的酶活性会不同 ，对每一菌株应 作标准曲线。测定方法： 按前述方法去除非粘附细菌后 ，于每 孔加 90μl含有 6-磷酸果糖 80 mg /ml、氟化钠 6 mg /ml、碘 乙酸钠 10 mg /ml、 0. 25% ( v /v ) Trito n X-100、 0. 05 mol /L 磷酸盐缓冲液加 0. 05% ( w /v )半胱氨酸 ， p H6. 5的反应混合 物 ， 37℃孵育 40 min。加 70μl 13. 9% ( w /v )刚用 NaO H中和 至 p H6. 5的盐酸羟胺 ，置室温 10 min。加 40μl 15% ( w /v )三 氯乙酸 ， 40 μl 4 mmo l /L HCl和 40 μl用 0. 1 mol /L HCl配 制的 FeCl3. 6 H2O( 50 mg /ml) ， 14 000 g离心 3 min。 用微孔 板光度计读取上清液 500 nm吸光度 ，该值对应于粘附细菌。定量每孔加入的总细菌如下： 离心 500 1细菌悬液 14, 000g 2 min,去上清 ，如上测定 F6PPK活性，对应于加入的总细菌。 粘附细菌的百分率 Adh% = ( A500粘附细菌 /A500加入总 细菌 )×100。为提高灵敏度，粘附检测可用 6孔板进行。体积可随板孔的大小调节以保持试剂的正确浓度。用同样的细菌 悬液进行的检测变异在1%～10%。在标准条件下进行的每一次检测每块板至少应包括2个参考菌株，其中一个粘附菌株，另一个为非粘附菌株。用此法可比较不同菌株之间的粘 附特性。 这种简单、可重复的方法即使在其他种细菌存在下也可用于定量检测双歧杆菌对真核细胞的粘附。 用定量 F6PPK所得结果在参考菌株间比较就粘附性来说与结晶紫 非特异性方法具有良好的相关性。粘附测定时也可细菌悬浮 于其自身的耗竭培养上清来进行 ，但应注意代谢终产物会影 响粘附作用。 Bibiloni等用此法测定 4株两歧双歧杆菌粘附 聚苯乙烯的百分率均值分别为 33. 01、 40. 54、 32. 74和 58. 2, 而 1株短双歧杆菌和 1株婴儿双歧杆菌的粘附百分率均值 分别为 39. 41和 4. 5。
1. 4 与肠细胞样细胞的相互作用
1. 4. 1 粘附 Ca co-2细胞肠道微生物群在胃肠内环境稳定中起重要作用，细菌与肠道细胞之间的相互作用非常重要，不仅因为附着的微生物更能抵抗清除机制，而且因为它们还能激发细胞应答。Caco-2细胞培养作为研究细菌与肠细胞之间相互作用的体外模型已被广为接受。这种细胞株源于人结肠腺癌，表现的形态和功能分化类似于肠细胞。Caco- 2单层细胞在会合后生长后期(21天培养)显示顶端微绒毛、功能性紧密连接和刷状缘酶活性，类似于肠上皮细胞。其它肠道细胞株(如HT-29、T84)也可用于研究细菌 -细胞相互作用。测定方法是：将Caco-2细胞(传代23或以上，约2×104细胞/cm2 )接种于6或24孔组织培养板，置37℃, 5% CO2-95%气压培养，每2d换液1次，至21d细胞达到会合后生长。用GKN缓冲液 ( NaCl8g / L、KCl0. 4g /L、葡萄糖2g / L、NaH2 PO4. H2O 0. 69g /L、Na2 HPO4 1. 57g / L, p H7. 2～7. 4)或不含胎牛血清的培养液洗涤单层细胞。加0. 5 ml( 24孔)或1 m l(6孔)细菌悬液( 600 nm吸光度约0. 5～1. 0)于含有1 ml GKN的细胞单层，混匀，置37℃1 h(不振荡 )。用GKN洗涤3次去掉非粘附细菌，用光学显微镜、扫描电镜、放射性标记细菌或F6PPK法检测细菌的粘附。
DM EM可用RPMI 1640或M EM代替不影响后果。细胞培养液添加剂应加以考虑 ，因 RPMI 1640中加入高浓度的非必需氨基酸会导致Caco-2细胞变圆、脱落。为保护单层细胞 ，所有洗涤应在室温或 37℃溶液进行。可用于粘附检测的最小细菌浓度取决于检测粘附时采用的方法。另一方面，菌悬液超过2. 0吸光度时对单层细胞会有损害。双歧杆菌的粘附性检测可在不同的技术基础上发展。若用光学显微镜检查，细胞应生长在玻璃盖片上。盖片的准备方法是：用 5% ( v /v )非离子去垢剂煮沸 5 min,自来水彻底冲洗，用96%乙醇洗5次 ， Milli-Q水洗5次，121℃灭菌15 min, 60℃干燥。光学显微镜检查法是将单层细胞用甲醇固定5 min或不用固定，于室温与0. 5 ml姬姆萨染液(1: 10磷酸盐缓冲液稀释姬姆萨贮存液 )孵育5 min,用K H2 PO4 ( 10 m M, p H7)冲洗，室温干燥。扫描电镜检查方法是用1 m lPBS配制的2. 5% ( v /v )冷戊二醛固定细胞1 h或置4℃过夜，将样品浸入逐级乙醇系列脱水(10～100% ( v /v )乙醇各10 min) ，样品可4℃ 70%乙醇贮存。异戊乙酸处理10 min后 ，于液态CO2中临界点干燥样品。将样品封固在扫描电镜支架上，以金-24真空挥发包被10 min。也可用放射性标记和F6PPK法检测。从特异性来说 ， F6PPK法是最适宜的方法，它得出的结果较活菌计数和光学显微镜检查重复性更好 ，不需要如放射性标记那样的特殊仪器。此外 ， F6PPK法可用于检测双歧杆菌与其它微生物结合的粘附 ，因为F6PPK是两歧杆菌独有的特性。真核生物ATP干扰生物发光结果，不宜使用。双歧杆菌菌株典型的粘附表现为大约10% 。实验室之间的变异可能很高，所以每次检测应包括粘附和非粘附质控菌株。用 F6PK法所作的粘附检测就相同菌株对CaCo-2细胞的粘附来说与光学显微镜检查和放射性标记均有良好的相关性。Bibilo ni等检测3株两歧双歧杆菌对Caco-2细胞的粘附率均值分别为14. 65% 、15. 61% 、15. 61, 1株短双歧杆菌和1株婴儿双歧杆菌的粘附率均值分别为1. 94%和5. 52%。
1. 4. 2 双歧杆菌与肠道病原在 Ca co-2细胞上的相互作用
Caco-2细胞系统已被广泛用于研究双歧杆菌拮抗肠道病原的作用 ，包括对病原性菌株粘附或侵袭的替换、竞争或排斥作用。检测对伴随病原排斥作用的方法是在Caco-2单层细胞上加0. 5 ml双歧杆菌悬液，置 37℃ 1 h。加0. 5 ml病原(105或106 CFU /ml)，置37℃ 1 h。用GKN洗3次去掉非粘附性细菌，加1 ml庆大霉素加(200g /ml, PBS配制 ) ，置37℃ 1 h,用GKN洗2次，1 ml无菌蒸馏水，置 37℃ 1 h以裂解单层细胞。以适当稀释度接种于营养琼脂 ，计算每孔中伴随病原的百分率： Ass% = (CFU伴随病原/CFU加入的总病原)×100。病原侵袭肠细胞可通过用庆大霉素处理 ，测定位于Caco-2细胞内的细菌来测定。因为该抗生素不扩散入真核细胞内，粘附在细胞边缘的细菌被杀灭，而侵入Caco-2细胞内的细菌不被杀死。方法是在上述检测对伴随病原排斥作用时，用GKN洗3次去掉非粘附性细菌后，加 1 ml庆大霉素( 200g /m l, PBS配帛) ，置37℃ 1 h。用GKN洗2次，加1 ml无菌蒸馏水，置37℃ 1 h。以适当稀释度接种于营养琼脂，计算每孔中侵袭百分率： 侵袭% = (CFU庆大毒素处理后/ CFU总加入病原菌)×100。注意庆大霉素浓度应根据个别菌株的敏感性来调节。Gopal等测定了鼠李糖乳杆菌 DR20、嗜酸乳杆菌HN017和乳酸双歧杆菌对HT-29、 Caco-2细胞和HT-29M TX细胞株的粘附性。这3株菌的粘附性虽有差别 ，但都能与现行的商业菌株嗜酸乳杆菌 LA-1、鼠李糖乳杆菌GG有可双性。3个菌株对分泌黏液的HT-29M TX细胞株的沾附指数较对其他2个细胞株高2～3倍。这3株细菌的培养上清2. 5倍浓缩液对大肠杆菌O157: H7粘附、侵袭肠细胞单层有抑制作用。乳酸脱氢酶、胰酶和蛋白酶K能部分影响这些细菌分泌到上清的抑制分子效应，说明这种抑制分子为蛋白性物质。
1.5 细菌表面化学特性的研究方法 在进行上述任何检测以前，将细菌作几种处理可以推断细菌表面的化学组成，用离液剂处理可确定是否有非共价键分子参与表面特性。蛋白因子可用蛋白裂解处理证实。偏过碘酸盐处理是验证这种特性是否有可氧化的碳水化合物所致的有效方法。处理方法为将细菌调节适当吸光度，取1 m l细菌悬液14 000 g 离心2 min。 去上请，分别用1 ml 3. 0 M 盐酸胍或5. 0 M氯化锂、50m M 偏过碘酸钠( PBS配制)、2. 5 /ml蛋白水解酶溶液悬浮沉淀 ，离液剂和蛋白水解酶处理者置 37℃ 1 h,偏过碘酸钠处理者，置室温 30 min。 用PBS洗2次，以相同缓冲液1 ml悬浮沉淀，按前述方法测定书水性指数、电位、凝集时间、血凝指数、对聚苯乙烯的粘附，对Caco-2细胞的粘附等。胰酶和糜蛋白酶用Tris-HCI 50 mM, NaCl 100 mM ， pH8配制，胃蛋白酶用盐酸-甘氨酸50m M, NaCl 100 nM, pH2. 2配制。一些双歧杆菌菌株经上述处理，参与粘附Caco-2细胞和一定程度HA的表面成分易被离液剂清除。这些表面决定簇可能是糖蛋白或碳水化合物链 ，因偏过碘酸钠处理影响粘附特性。对粘附Ca co-2细胞和HA来说 ，一些双歧杆菌菌株对胃蛋白酶比对其它蛋白酶敏感，胰酶和糜蛋白酶对不同的攻株效果不同，揭示表面特性随菌株的差异。Del Re等[16]比较了从人胃液和肠道分离的13株双歧杆菌的疏水性、自凝和对 Caco-2细胞的粘附作用 ，发现如果菌株个有自凝性和表面疏水性 ，则该菌株也能粘附细胞单层。
1. 6 人回肠造口引流糖蛋白作为小肠黏液的模型将人回肠造口引流用蒸馏水溶解、匀浆 , 10 000 g离心30 min,取清亮上清冻干，贮存于-18℃。冻干的回肠造口引流糖蛋白溶解(1mg /ml)于HEPES-Ha nks缓冲液(HH, 10 m M HE PES, p H7. 4) ，取100 l溶液加入聚苯乙烯微孔板上，置4℃过夜，使糖蛋白固定于孔内。各孔用250 l HH缓冲冲洗 2次，加放射性标记的菌悬液 ( 600 mm 吸光度细菌。粘附细胞用1% SDS-0. 1M NaO H60℃孵育1 h使之脱落裂解。裂解悬液的放射活性用液体闪烁仪测定，计算结合细菌占加入细菌的百分比 ,即为粘附率。Tuomola等用此法测定了乳杆菌12株、乳球菌和丙酸杆菌各1株对人回肠造口引流糖蛋白的粘附性，以粘附和非粘附大肠杆菌作对照，所有的菌株也同时做聚苯乙烯粘附试验。测试的菌株对回肠造口引流糖蛋白与对聚苯乙烯的粘附有显著差异。自人分离的菌株能粘附回肠造口引流糖蛋白。粘附是浓度依赖性的，大多数粘附菌株能够饱和附着层。Ouw ehand等用此模型研究乳酸双歧杆菌 Bb12株对人回肠造口引流糖蛋白的粘附性时发现 ，乳杆菌GG和保加利亚乳杆菌的存在，可成倍增强双歧杆菌的粘附性。这种粘附性的增强与细菌之间的共聚集无关，提示益生菌的联合应用可得到协同的粘附效果。
1. 7 从人粪便提取黏液研究双歧杆菌的黏附作用Ouwe- hand等建立了用人粪便提取黏液研究益生菌黏附作用的方法：将人粪便悬浮于冰冷PBS(10 mM 磷酸盐，pH7.2)内含0. 5 g /L NaN3以防细菌生长，1 mM苯甲磺酰氟抑制丝氨酸蛋白酶，2mM碘乙酰胺抑制含半胱氨酸酶，10m MEDTA抑制金属蛋白酶。悬液置 4℃振荡，4℃ 15 000g离心 30 min。取清亮上清，用冰冷乙醇(终浓度60% ( v /v ) ) 沉淀黏液2次，用超纯水再悬浮，冰冻干燥。用 HH缓冲注将黏液配成 1 mg /ml, 2 000 g离心 5 min去除不溶物。将清亮上清 4℃过夜包被于聚苯乙烯微孔板 ，每孔 100 l。这样处理足以使黏液覆盖微孔。各孔用250 l HH缓冲液洗 2次 ，去除多余的黏液。每孔加放射性标记的菌悬液(600nm吸光度0. 50±0. 01) 100 l,置37℃ 1 h。各孔用250 lHH缓冲液洗2次以去掉非粘附性细菌。每孔加1% SDS-0.1M NaOH250 l, 60℃孵育1 h使结合的细菌脱落裂解。裂解悬液的放射活性用液体闪烁仪测定。 测得乳杆菌菌株的粘附率在3% ～43%不等。粘附菌株紧密地结合在固定的黏液上 ，菌株的表面疏水性与粘附能力没有相关性。Kirjav ainen等测定了乳杆菌和两歧杆菌菌株对来自成人和婴儿组的粘淮的粘附性，所有菌株对成人的黏液较对婴儿的黏液粘附性强。
Ouw ehand 等测定4株双歧杆菌对来自于新生儿、2月、6月婴儿、成人( 25～52岁)和老人( 74～93岁)黏液的粘附性 ， 4株双歧杆菌对老人黏液的粘附性均胝于其他年龄组。其中2株双歧杆菌对 6月婴儿和成人黏液的粘附性低于对2月婴儿黏液的粘附性。He等比较24株双歧杆菌对人类粪便黏液和牛肠黏液糖蛋白的糖附性，发现青春双歧杆菌、角双歧杆菌、双歧双歧杆菌、短双歧杆菌、串珠双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌和假串珠双歧杆菌对抗人粪便黏液较对牛肠黏液糖蛋白的粘附性。动物双歧杆菌和乳酸双歧杆菌则没有差别，这说明双歧杆菌对不同种来源黏液的粘附性随菌株而异，粘附黏液的双歧杆菌则没有差别，这说明双歧杆菌对不同种来源黏液的粘附性随菌株而异，粘附黏液的人双歧杆菌更具有宿主特异性。
Ouwehand等研究用不同方法灭活的益生菌对肠黏液的粘附性，紫外线灭活的益生菌粘附性与活菌没有显著差异，加热灭活乳酸乳球菌和干酪乳杆菌粘附性显著降低。经80℃灭活的乳酸双歧杆菌和丙酸杆菌粘附性反而增强，射线灭活的所有菌株粘附性均降低，仅干酪乳杆菌例外，其粘附性反而增强，这说明有的灭活益生菌仍具有粘附能力。Jun- tunen等研究了益生菌对健康婴儿和轮状病毒感染期间肠黏液的粘附性。发现轮状病毒腹泻并不减少粪便黏液素的产生 ,也不改变益生菌对黏液的粘附性。但鼠李糖乳杆菌GG的存在可显著增强乳酸双歧杆菌 Bb12的粘附性，从31%增加到39% ，在腹泻期间从26%增加到44% 。这说明联合应用特定益生菌菌株，可协同增强粘附性。He等测定51株来自健康成人( 30～40岁 )和老人(70岁以上)的双歧杆菌对黏液的粘附性。自健康成人分离的双歧杆菌较从老人分离者具有更好的粘附性，揭示人类双歧杆菌菌群对黏液的粘附性也随宿主年老而降低。比较自健康婴儿和过敏婴儿分离的双歧杆菌发现 ,过敏婴儿具有成人的双歧杆菌菌群 ，以青春双歧 杆菌居多。 健康婴儿具有典型的婴儿双歧杆菌菌群 ，以两歧 双歧杆菌居多。健康婴儿的双歧杆菌对黏液的粘附性显著高 于过敏婴儿的双歧杆菌。说明过敏性疾病可能与肠道双歧杆菌菌群对黏液的粘附性降低有关。 (待续)
本文转载于中国微生态学杂志2002年6月第14卷第3期 ChineseJournalofM icroecology．June，2002，Voll4No3
