还原型谷胱甘肽的英文名为:Ｌ Ｇｌｕ ｔａｔｈｉｏｎｅ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｌ、ＧＳＨ等(简称为ＧＳＨ),化学名:Ｎ (Ｎ Ｌ γ Ｇｌｕｔａｍｙｌ Ｌ ｃｙｓｔｅｉｎｙｌ)ｇｌｙｃｉｎｅ,即Ｎ (Ｎ Ｌ γ 谷氨酰 Ｌ 半胱氨酰)甘氨酸,它是由谷氨酸、半胱胺酸和甘氨酸构成的三肽,其中谷氨酸是以γ 羧基与半胱氨酸形成肽键,其分子结构如下:
早在1888年,ＧＳＨ就已由ｄｅＲｅｙ Ｐａｉｌ ｈａｄｅ,Ｊ.首先从酵母中分离出来,1921年Ｈｏｐｋｉｎｓ得到结晶,1929年Ｈｏｐｋｉｎｓ、Ｋｅｎｄａｌｌ等提出ＧＳＨ为三肽,1935年由Ｈａｒｉｎｇｔｏｎ和Ｍｅａｄ阐明其化学结构并加以合成。
ＧＳＨ存在于所有生物细胞中,而以酵母、谷物种子胚芽;人体和动物的心脏、肝脏、肾、红细胞和眼睛晶状体中含量较高。正常人体内还原性谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽(ＧＳＳＧ)的比例为100:1,全血中ＧＳＨ的正常浓度约为37.1ｍｇ/ｄｌ,人体的肝脏和肾脏是ＧＳＨ主要的合成、代谢和排泄器官。谷胱甘肽的主要生物学功能是保护生物体内蛋白质的巯基进而维护蛋白质的正常生物活性,同时它又是多种酶的辅酶和辅基。ＧＳＨ的重要生物学功能与谷胱甘肽的分子结构有密切关系,例如ＧＳＨ分子中的巯基参与中和氧自由基、解毒等重要功能;所含的γ 谷氨酰胺键能维持分子的稳定性并参与转运氨基酸;ＧＳＨ中的甘氨酸和半胱氨酸残基参与胆酸的代谢等。
近年来,随着对ＧＳＨ的生理、生化等方面研究的深入,ＧＳＨ在医学、食品、保健、防衰老等方面正引起人们日益广泛的注意,本文对这些方面的进展以及ＧＳＨ的生产方法作一简述。
1 ＧＳＨ在医学上的主要应用
1.1 抗自由基,保护细胞ＧＳＨ可以作为谷胱甘肽过氧化物酶的底物,抑制脂质过氧化,保护细胞膜,恢复细胞功能。ＧＳＨ可保护细胞内含巯基酶的活性(如ＡＴＰ酶)、防止因巯基氧化而导致的蛋白质变性(如血红蛋白)、减少自由基对ＤＮＡ的攻击从而减少ＤＮＡ损伤和突变。谷胱甘肽还可通过巯基与体内的自由基结合转化成容易代谢的酸类物质,从而加速自由基的排泄。
1.2 解除外源性有毒物质(包括药物)的毒性 ＧＳＨ可直接与某些毒物结合而排出体外;或者先经肝脏细胞色素Ｐ代谢酶系氧化和羟化,然后在谷胱甘肽 硫 转移酶作用下与谷胱甘肽结合成大分子结合物而使毒物灭活并增加水溶性,最后以降解等方式经胆汁和肾脏排出体外。
1.3 促进细胞合成蛋白质ＧＳＨ可通过γ 谷氨酰基转运酶直接进入细胞内,并通过γ 谷氨酰基循环参与众多氨基酸向细胞内转运,进而促进蛋白质的合成。
1.4 参与转甲基、转丙氨基反应,维持肝细胞正常功能ＧＳＨ能加强转甲基和转丙氨基反应,因而能促进ＡＴＰ和凝血因子的合成,并能促进氨基酸及脂肪代谢、促进雌激素的灭活和减轻低白蛋白血症。
1.5 参与胆红素代谢 ＧＳＨ可以在谷胱甘肽硫转移酶的作用下,将未结合胆红素载入微粒体,使其与葡萄糖醛酸结合成结合型胆红素排出体外。
1.6 促进胆酸代谢,减轻出血倾向ＧＳＨ能向肝脏提供甘氨酸及牛磺酸,保证甘氨酸及牛磺酸型结合胆酸的合成,促进消化道对脂溶性维生素(Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ)的吸收,ＧＳＨ能向肝脏提供甘氨酸及牛磺酸,保证甘氨酸及牛磺酸型结合胆酸的合成,促进消化道对脂溶性维生素(Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｋ)的吸收,从而促进肝脏合成维生素Ｋ依赖性的凝血因子(ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ),减少出血倾向。
2 ＧＳＨ在食品工业上的应用
2.1 ＧＳＨ在面制品加工中的应用日常消费的面制品中ＧＳＨ含量通常都低,经过加工后几乎损失殆尽。在我国,随着经济发展和生活水平的提高,消费者的食物结构有了很大的改变,从日常食物中摄入的必需氨基酸,如赖氨酸、蛋氨酸等一般并不缺乏,而食品中的某些功能性因子例如ＧＳＨ等却常常缺乏,面制品中加入ＧＳＨ可大大强化其营养价值。在面制品加工中加入ＧＳＨ或与蛋白水解酶合用可减少和面时的水用量、改善面团的流变特性、大范围控制面团粘度、降低面团强度而使得混合及挤压成型变得容易,并可缩短产品的干燥时间;在面条加工中,加入谷胱甘肽作为酪氨酸酶的抑制剂,可以防止不愉快的色泽变化;在谷类和豆类混合制粉时,加入谷胱甘肽作还原剂能保持原有和所需的色泽;在富含蛋白质的大麦粉、豆粉中加入ＧＳＨ可有效地防止酶促和非酶促的褐变;ＧＳＨ还能抑制氨基酸与葡萄糖加热下产生有色及有害物质。
2.2 在奶制品中的应用在奶酪生产中加入ＧＳＨ和其它添加剂,可大大增强其令人喜爱的风味而提高奶酪质量和加快奶酪的成熟;在酸奶中加入ＧＳＨ能起到抗氧剂的稳定质量作用;在酪蛋白、脱脂奶粉、婴儿奶粉中加入ＧＳＨ可有效地防止酶促和非酶促的褐变。
2.3 在肉类、禽类、鱼类和海鲜食品中的应用ＧＳＨ具有抗氧化作用,在鱼类、肉和禽类食品加工中加入ＧＳＨ可抑制核酸分解、强化食品的风味并大大延长保鲜期。例如ＧＳＨ可以较有效地防止冷冻鱼片的鱼皮褪色、鱼肉的褐变;ＧＳＨ在保持和增强新鲜海鲜的特有风味上也有重要作用;在与谷氨酸、核酸类呈味剂混合共存时,会有很强的肉类风味。
2.4 在水果、蔬菜类食品及饮料上的应用水果、蔬菜类食品加工中加入谷胱甘肽可以有效地防止褐变并保持原有的诱人色泽、风味和营养。例如,苹果和土豆的加工产品、苹果汁、葡萄汁、菠萝汁、橘汁和柚汁的酶促和非酶促的褐变的防止。在日本的传统饮料清酒的生产中,应用发酵力强并渗漏ＧＳＨ的酵母已酿出谷胱甘肽含量高的产品,以提高其营养和保健功能;酿造高含量ＧＳＨ的抗癌系列啤酒我国也已有专利;ＧＳＨ还可用作起泡葡萄酒的还原剂。
2.5 在保健性功能食品上的应用我国的改革开放政策已使得广大人民群众的生活水平有了很大提高,对于绝大多数(尤其是中心城市)的消费者来说,碳水化合物和蛋白质的日常摄入量已足够或过量,因而人们已逐渐将食品消费的注意s力转向保健和延年益寿等方面上,国外发达国家则早已如此。在此情况下,研制和生产出效果确切、有效成分稳定、口味良好和消费者经济上能够承受的保健食品将是食品工业所面临的重大课题和机遇。有关专家认为:功能性食品将是这方面的发展趋势(或叫作新的增长点),而功能性食品的发展方向中,帮助人体排毒和泄毒的功能性食品将是发展主流,其原因是众所周知的,而ＧＳＨ则是为数不多的能符合此发展潮流的重要功能因子之一。
3 ＧＳＨ的生产
按ＧＳＨ生产方法的发展进程来看,主要有萃取法、化学合成法、发酵法、固定化细胞(或酶)法。
3.1 萃取法ＧＳＨ的早期生产都是采用萃取法,这是生产ＧＳＨ的经典方法,也是发酵法生产流程中的下游过程基础。植物种子胚芽、酵母都可作为原料萃取提取,但以酵母作原料居多。从酵母中提取ＧＳＨ的流程大致如下:压榨酵母-->丙酮脱脂-->过滤-->固相悬浮于水中剧烈搅拌匀浆-->加入硅藻土-->过滤-->滤液中加硫酸至0.5ｍｏｌ/Ｌ,保温50℃加Ｃｕ2Ｏ,搅拌后沉降30ｍｉｎ-->过滤-->水洗至无硫酸根-->谷胱甘肽铜盐水中溶解-->通入Ｈ2Ｓ除去铜离子-->过滤-->滤液中通入Ｎ2排去Ｈ2Ｓ-->真空浓缩结晶-->过滤-->结晶用少量热水溶解-->加酒精结晶-->无水酒精洗晶体-->真空干燥。萃取法生产ＧＳＨ所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和稀醇等。用以上方法制取ＧＳＨ,纯度和收率不高,若要用作药品或试剂,则需进一步纯化,纯化方法一般是在萃取法中组合离子交换等色层分离步骤。
3.2 化学合成法自还原型谷胱甘肽被发现和阐明化学结构时,就有学者开始致力于化学合成的研究,目前谷胱甘肽的化学合成生产工艺已较成熟,但存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂、需光学拆分且存在环境污染等问题。化学合成ＧＳＨ有多种方法,可参阅有关化学文献。
3.3 发酵法早期的萃取法生产谷胱甘肽过程中,所用的酵母都未经选育和遗传特性上的改造,谷胱甘肽含量低,仅为0.5%～1.0%(干基),加上萃取工艺本身步骤多而复杂,使得萃取法生产ＧＳＨ的总收率很低。发酵法生产ＧＳＨ就是选育(或构建)ＧＳＨ合成能力强和胞内含量高的微生物、筛选和优化培养基配方、建立和优化发酵控制策略、改进和提高下游过程技术等,最终提高ＧＳＨ的产率和质量。发酵法生产ＧＳＨ所采用的微生物一般是酵母,但应用基因工程技术构建大肠杆菌工程菌来生产ＧＳＨ的研究也有了很大进展。
3.3.1 采用酵母的发酵法生产发酵所用菌种一般是酿酒酵母(Ｓａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)及假丝酵母属(Ｃａｎｄｉｄａ)中的某些种,选育方法则多采用诱变后筛选某些物质(乙硫氨酸、Ｚｎ2+等)的抗性株,例如:出发株Ｋ11(Ｃａｎｄｉｄａｓｐ.)-->摇瓶培养15ｈ-->制菌悬液紫外诱变乙硫氨酸平皿分离-->Ｋ11ＵＥ081(不稳定株)-->乙硫氨酸平皿分离-->Ｋ11ＵＥ100(对乙硫氨酸抗性强)-->紫外诱变-->乙硫氨酸平皿分离-->Ｋ11ＵＥ126(ＧＳＨ稳定高产株)Ｋ11ＵＥ126的ＧＳＨ合成能力比出发株提高49.7%。
由于ＧＳＨ是胞内产物,所以在提高菌株的ＧＳＨ合成能力的同时,发酵培养时还应设法提高细胞浓度。提高发酵最终的酵母细胞浓度和胞内ＧＳＨ含量,可采用不同方法,例如①由酵母发酵活力与比生长速率的关联式,结合指数流加培养模式等,实现酵母培养过程的高产率和高发酵活力的统一。②研究添加氨基酸和酵母膏对ＧＳＨ合成的影响。添加0.6%酵母膏并补糖,可使ＧＳＨ总量提高48%。③酵母的分批发酵培养中控制比生长速率、对乙醇浓度的模糊控制等,使ＧＳＨ生产能力最大化。
3.3.2 采用大肠杆菌工程菌的发酵法生产80年代以来,随着基因工程技术的飞速发展,应用基因工程技术构建大肠杆菌ＧＳＨ生产菌的研究有了很大进展。从已发表的文献和专利来看,大多属日本学者的成果。Ｌ 谷氨酸+Ｌ 半胱氨酸+ＡＴＰＧＳＨ Ｉγ 谷氨酰 Ｌ 半胱氨酸+ＡＤＰ+Ｐｉ(1)γ 谷氨酰 Ｌ 半胱氨酸+Ｌ 甘氨酸+ＡＴＰＧＳＨ ＩＩ还原型谷胱甘肽+ＡＤＰ+Ｐｉ(2)式中ＧＳＨ Ｉ:γ 谷氨酰 Ｌ 半胱氨酸合成酶(谷胱甘肽合成酶Ｉ);ＧＳＨ ＩＩ:谷胱甘肽合成酶(谷胱甘肽合成酶ＩＩ);Ｐｉ:无机磷酸。大肠杆菌的ＧＳＨ合成途径如下:ＧＳＨ Ｉ受ＧＳＨ的反馈抑制,ＧＳＨ ＩＩ受ＧＳＳＧ(氧化型谷胱甘肽)的反馈抑制。Ｍｕｒａｔａ等使用Ｅ.ｃｏｌｉＢ突变株Ｃ912(无ＧＳＨ Ｉ活性)、ＲＣ912(Ｃ912的回复子,具有对ＧＳＨ反馈抑制脱敏的ＧＳＨ Ｉ活性),将ＲＣ912的染色体ＤＮＡ和ｐＢＲ322质粒用数种限制性内切酶消化,然后用Ｔ4ＤＮＡ连接酶连接后转化Ｃ912,筛选得二硫化四甲基秋兰姆(ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｔｈｉｕｒａｍｄｉｓｕｌｆｉｄｅ)抗性菌落即为转化子,20个转化子中3个显示出较高的ＧＳＨ Ｉ活性,将其中ＧＳＨＩ活性最高的菌株的嵌合质粒ＤＮＡｐＢＲ322 ｇｓｈＩ分离并转化入ＲＣ912,得到的含ｐＢＲ322 ｇｓｈＩ的ＲＣ912的ＧＳＨ Ｉ活性比不含ｐＢＲ322 ｇｓｈＩ的ＲＣ912高4倍。用类似的方法可将ＲＣ912的基因ｇｓｈ ＩＩ克隆并扩增。在重组大肠杆菌发酵产ＧＳＨ的研究方面,我国学者近年来也做了不少工作。例如李寅等对韩国的重组大肠杆菌作了较系统研究,在摇瓶培养中考察了ＧＳＨ的前体氨基酸、ＡＴＰ对胞内ＧＳＨ积累的影响,试验表明流加前体氨基酸、ＡＴＰ和氨苄青霉素可使胞内ＧＳＨ含量有所提高,但菌体生长受到明显抑制;在2Ｌ发酵罐中不用纯氧通气、采用葡萄糖的指数流加方式、不加ＡＴＰ和前体氨基酸,发酵25ｈ,细胞干重和发酵液内ＧＳＨ分别达到80ｇ/Ｌ、880ｍｇ/Ｌ。
3.3.3 固定化细胞(或酶)法用固定化细胞(酶)作为ＧＳＨ生物合成系统具有生产过程简化、生产效率提高等优点。此外对于基因工程菌而言,固定化培养与传统的培养方式相比也具有一定优势,例如:大规模培养过程中工程菌的稳定性问题有可能得到较好解决、在稀溶液体系中具有较高的细胞浓度、克隆产物可长期生产、细胞可得到介质的保护、有时无需进行产物分离、反应器中积累高浓度产物、较好的传质特性、便于自动控制等。与其他经济上可行的工业化固定化细胞(酶)生物合成系统一样,辅助因子的循环再生或提供是必不可少的。由于从前体氨基酸生物合成ＧＳＨ,二步酶促反应都需消耗ＡＴＰ,因而ＡＴＰ的循环再生或提供是固定化细胞(酶)生产ＧＳＨ的关键。固定化细胞(酶)法生产ＧＳＨ的研究中应用过的ＡＴＰ利用系统有葡聚糖结合的ＡＴＰ、酵母细胞的酵解途径、大肠杆菌的乙酸激酶系统、反应介质中直接加入ＡＴＰ等等,而ＧＳＨ的合成则可采用酿酒酵母和大肠杆菌细胞或它们的合成酶系等。例如:①将具有乙酸激酶系统和ＧＳＨ合成酶系的大肠杆菌用角叉菜聚糖胶固定化并用六亚甲基二胺和戊二醛作硬化处理,在由固定化细胞、ＧＳＨ的前体氨基酸和乙酰磷酸盐等构成的柱系统中,ＧＳＨ得到连续合成,柱的半衰期为8ｄ。②酿酒酵母(或大肠杆菌)细胞用聚丙烯酰胺固定化后作用于ＧＳＨ的前体氨基酸等基质生产ＧＳＨ;酿酒酵母细胞(作酵解产ＡＴＰ系统)和大肠杆菌细胞(作ＧＳＨ合成系统)用聚丙烯酰胺共固定化(ｃｏ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ),或将两者分别用聚丙烯酰胺制成固定化细胞后混合使用。后两者的ＧＳＨ合成效率高于前者。
我国赵旭东等对固定化酵母细胞生物合成谷胱甘肽也作了较系统和深入的研究,反应体系振荡反应8ｈ,ＧＳＨ可达0.91ｇ/Ｌ,实验结果还显示ＡＤＰ有可能抑制酵母细胞的ＧＳＨ合成。
据世界权威的氨基酸市场分析家预测,世界药用氨基酸的需求将以每年二位数的幅度增长,仅以美国市场为例,1998年肠道吸收和注射用氨基酸需求量为5000吨,膳食补充和药品/中间体氨基酸需求为3.0 106磅。这类纯度要求高的氨基酸虽然占世界氨基酸总产量的比例不大,但占总价值的比例却迅速扩张。专家认为,造成这种状况的主要原因是市场对单对映体药物需求的日益增长。首先,不少氨基酸类产品(如ＧＳＨ)本身可被用作药物,其次氨基酸被广泛用作药物分子的活性结构模块而为药物分子引入手性。1997年,世界单对映体药物的销售额是879亿美元,比1996年增长了21%,约占世界药品销售总额的28.3%,而1997年世界上销售的300种主要药品中53%具有手性。
针对上述情况,世界主要的氨基酸制造商如Ｋｙｏｗａ、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ和Ｄｅｇｕｓｓａ等都相继投巨资于氨基酸的研究与开发,仅Ｋｙｏｗａ1998年的氨基酸研究与开发就耗费达1.9亿美元,而ＧＳＨ是其重点产品之一,Ｋｙｏｗａ目前是ＧＳＨ主要供应商。
萃取法少量生产ＧＳＨ在我国早有成功先例,但生产工艺落后、规模小、产量低而质量差。随着人们对ＧＳＨ研究及认识的不断深入,ＧＳＨ的市场需求正迅速扩大,抓紧开发研制并投入生产已成当务之急。
