亲和层析的原理 利用分子间存在特异性的相互作用它们之间都能够进行专一而
又可逆的结合这种结合力就称为亲和力。
常见具有专一性亲和力的生物分子对
酶 基质类似物抑制剂辅酶
抗体 抗原病毒细胞
细胞 细胞表面特异蛋白外源凝集素
核酸 互补碱基序列组蛋白核酸聚合酶
激素或药物 受体载体蛋白
外源凝集素 多糖糖蛋白细胞表面受体细胞
文献将被固定在色谱基质上的分子称为配体配体和基质是共价结合的构成亲
和层析的固定相称为亲和吸附剂。
配体以共价键结合到活化的基质上构成固相载体 。
一般载体采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。
咪唑环是 13 二氮杂戊环英文名是 Imidazole,如果在第一位或第三位上的
氮原子上去掉那个氢原子所剩余的部份就叫咪唑基。就是咪唑上去掉一个和氮
原子直接相连的氢原子后剩下的部分
组氨酸的性质具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。
金属离子Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与 N、S 和 O 等供电原子
产生配位键因此可与蛋白质表面的组氨酸His的咪唑基、半胱氨酸Cys
的巯基和色氨酸Trp的吲哚基发生亲和结合作用其中以 His 的咪唑基的结
合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是 Cu2+Ni2+Zn2+≥
Co2+ 。
镍离子有六个螯合价位通常将镍柱分为了 Ni-NTA 和 Ni-IDA。Ni-NTA 螯合了
四价剩余两价而 Ni-IDA 螯合三价剩余三价。因此 Ni-IDA Agarose 结合作
用力要比 Ni-NTA Agarose 强在同样条件下 Ni-IDA Agarose 的载量要比 Ni-NTA
高而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高但 Ni-NTA 更稳定
耐受更强的还原剂镍离子更不易脱落。因此需要根据不同的纯化条件选择纯化
所需的镍柱以达到纯化的最佳效果
基质
①不溶性的多孔网状结构渗透性好
②物理和化学稳定性高有较高的机械强度使用寿命长
③抗微生物和酶的侵蚀
④最好为粒径均一的球形粒子
⑤具有亲水性无非特异性吸附
⑥含有可活化的反应基团利于亲和配体的固定化。
例琼脂糖凝胶微球的商品名为 Sepharose含糖浓度为 2%、4%、6%时分别称为
2B、4B、6B。Sepharose 4B 的结构比 6B 疏松而吸附容量比 2B 大所以 4B 应
用最广。
配基是可以可逆结合特定分子或特定基团的分子能够通过亲和色谱的方式进
行纯化。
配基的选择受到两种因素的影响1配基与目标物的结合必须具有特异性
和可逆。
2必须具有化学修饰基团使它吸附在基质上并且不损害它的活性。
间隔臂目标蛋白质的结合位点位于分子中较深的部位如果将配基直接偶联到
基质上受到空间位阻的影响配基不能到达目标蛋白的结合位点因此与目标
蛋白的结合能力低。于是在配基与基质之间插入一个间隔臂可以使结合更加容
易。间隔臂使结合最大化的同时要避免非特异性结合。
间隔臂的长度是关键太短无效; 太长发生非特异性结合。一般规则偶联
的分子量小于 1000 时使用间隔臂当大分子量则不一定要。
二硫键蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间形成包内蛋白离开细胞后二硫键
常以氧化状态存在。
此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构首
先必须将二硫键打开使成为线状多肽链。
上样方式1直接上样 2间接上样
洗脱方式1pH 值洗脱pH 的改变可以改变带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程
度使它们结合位点的亲和性降低。降低 pH 的方法
2)离子强度洗脱
(3)竞争性洗脱咪唑
再生(1)先用强变性剂 6M 盐酸胍冲洗柱子
(2)用水冲洗干净
(3)0.2%SDS 冲洗柱子
(4)用水冲洗干净
(5)50%乙醇冲洗柱子
(6)用水冲洗干净
(7)用 100mM EDTA(50mM Tris 100mM EDTA PH 8.0)冲洗柱子
(8)用水冲洗干净
(9)用 100mM 硫酸镍孵育柱子
(10)20%乙醇中 4℃保存
上清缓冲液及配方
上清纯化缓冲液 配方
Lysis Buffer
50mM Tris-HCl150mM NaCl20mM ImidazolepH8.0
Elution Buffer 1
50mM Tris-HCl150mM NaCl50mM ImidazolepH8.0
Elution Buffer 2
50mM Tris-HCl150mM NaCl100mM ImidazolepH8.0
Elution Buffer 3
50mM Tris-HCl150mM NaCl300mM ImidazolepH8.0
包涵体缓冲液及配方
包涵体纯化缓冲液
配方
IB Lysis Buffer 1
20mM Tris150mM NaCl2mM EDTA2mMDTT
1% Triton X-100PH8.0
IB Lysis Buffer 2
50mM Tris-HCl150mM NaCl 8Murea pH8.0
IB Elution Buffer1
50mM Tris-HCl 150mMNaCl20mMImidazola 8Murea
pH8.0
IB Elution Buffer2
50mM Tris-HCl 150mMNaCl50mMImidazola 8Murea
pH8.0
IB Elution Buffer3
50mM Tris-HCl 150mMNaCl100mMImidazola 8Murea
pH8.0
IB Elution Buffer4
50mM Tris-HCl 150mMNaCl300mMImidazola8Murea
pH8.0
IB Elution Buffer5
50mM Tris-HCl 150mMNaCl500mMImidazola8Murea
pH8.0
试剂及作用
1.TritonX -100(曲拉通)具亲水端和疏水端可将膜蛋白从细胞膜上解离下来
达到提取膜蛋白的作用。常用的非离子性去垢剂。用量1%-3%TritonX -100。
2.TCEP三(2-羧乙基)膦是一种非常有效的硫醇类还原剂广泛用作蛋白质
化学及蛋白质组学研究中二硫键的定量还原剂。该试剂在水溶液中的稳定性和溶
解性都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原剂
如 DTT 相比TCEP 不仅是一种高效的二硫键还原剂而且在某些巯基的交联
反应中不需要除掉。用量1mM/ml.
3.Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)抑制酸性蛋白酶配置时溶于甲醇中在水中不
溶解。用量1ug/ml。Store at:-4℃A week/-20℃Half a year。
4.Leupeptin(亮抑蛋白酶肽)抑制丝氨酸和巯基蛋白酶配置时溶于水用量
1ug/ml。Store at:-4℃A week/-20℃Half a year。
5.EDTA乙二胺四乙酸螯合剂消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑
制作用。不影响蛋白质功能的情况下去除干扰金属离子但是同时能使金属蛋白
酶丧失活性。用量0.1—5mmol/L。
6.Glycerol(甘油)增加黏度减少分子间的碰撞用量5%-30%。
7.SDS 十二烷基硫酸钠能够使蛋白质变性的阴离子型去污剂用量0.1%-1%。
8.TritonX -114(曲拉通)温度在 22℃以上时在蛋白质溶液中加入 2%的 TritonX
-114 可使蛋白质从去垢剂相和液相中分离可溶性蛋白在液相中而膜蛋白则进
入了去垢相中。内毒素存在于细胞壁组分菌裂解后释出物中。
9.DTT二硫苏糖醇常常被用于蛋白质中二硫键的还原可用于阻止蛋白质
中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但 DTT 往往无法还
原包埋于蛋白质结构内部溶剂不可及的二硫键这类二硫键的还原常常需要
先将蛋白质变性高温加热或加入变性剂如 6M 盐酸胍、8M 尿素或 1%SDS。
用量1-2mM.
10.L-Arginine(L-精氨酸)增加蛋白质的溶解性阻止蛋白质分子间通过疏水作
用发生凝聚而产生沉淀。用量0.4-0.6mol/L.
