1.pss 催化的转酯反应
取 1ml 酶液进行反应, 利用 HPLC 外标法测定产物磷脂酰丝氨酸生成量, 从而计算底物大豆卵磷脂的转化率。6h 后, 测定转酯反应共生成的磷脂酰丝氨酸量。
在本实验中, 酶活反应在下述体系中进行反应: 30ml 的0.1mol/L醋酸钠缓冲液( pH5.5) 中含有0.15mol/L 丝氨酸, 同时加入1ml 纯化后的重组磷脂酰丝氨酸合成酶, 与 15ml 含有 0.75mmol 卵磷脂的氯仿行混合, 在 30℃下 200r/min 混合得到均匀的乳状液进行反应。反应 6h 后, 停止转动, 双液相静止分层。提取 1ml 有机相, 经挥发后,剩余物经氯仿洗涤两次, 最后溶解于 50μ l 氯仿中,HPLC 法分析产物生成量。采用的流动相为乙腈: 甲醇: 85%磷酸=100: 10: 0.8, 检测波长206nm, 样品进样量15μ l, 流速为1.0ml/min, 利用外标法( 以磷脂酰丝氨酸标准品为外标物) 计算底物卵磷脂的转化率。
磷脂酰丝氨酸合成酶的酶活定义为: pH5.5、30℃下, 每小时转化1μ mol 大豆卵磷脂所需要的酶量( mg) 。
2.酶联比色法
pss 催化水解 L-α-卵磷脂生成胆碱胆碱在胆碱氧化酶的作用下生成过氧化氢过氧化氢在过氧化酶的作用下与 4-氨基氨替比林和苯酚生成醌亚胺显色物质在 A=500nm 下具有吸光值。
反应体系将 220mg 的 L-α-卵磷脂溶于含有 3mL50mM 的 SDS溶液、6mL1MNaOAc 缓冲液pH=8.0)、39mL 的去离子水、0.272mL17.9%的乙醇溶液终浓为 1%的混合体系作为底物溶解液。
将 39mg4-氨基氨替比林、80mg 苯酚及 8mg 过氧化酶溶于 5.5mL 的100mM Tris HCl (pH=8)缓冲液中作为胆碱显色剂。取 2.4mL 底物溶液、0.3mL 的 500mM CaCl 2 溶液、0.2mL 的去离子水混合并置于 35℃反应 10min,沸水浴终止反应待冷却至室温加入 0.05mL 2M Tris HCl(pH=9)缓冲液混合并离心后上清用 0.45μm 微孔滤膜过滤取滤液 2mL 与 0.1mL 胆碱显色剂、0.1mL 胆碱氧化酶溶液室温反应 2.5h.
在反应混合物中加入 2.0mL 去离子水离心得到澄清透亮的粉红色溶液最后于 A 500nm 检测吸光值。
酶活定义pH=8.0、T=35℃时磷脂酰丝氨酸合成酶 1h 内催化水解 L-α-卵磷脂释放 1.0μmol 的胆碱所需要的酶量。
