唾液酸修饰绿原酸脂质体制备及其体外抗肿瘤活性研究

绿原酸（chlorogenic acid ，CA ）是金银花、杜仲等药材的重要活性成分[1-3] ，是由反式肉桂酸与奎尼酸组成的多酚类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗紫外光与辐射、免疫调节、调血脂、降血糖等药理作用[4-6] ，具有重要应用开发前景。但绿原酸为极性有机酸，受热见光易氧化，结构不稳定，生物利用度低[7-8] 。纳米脂质体作为药物载体具有良好的生物相容性[9] ，脂质体包裹的药物可以有效地防止药物氧化、提高药物光稳定性和体内的吸收[10] 。脂质体包载绿原酸可以克服绿原酸的不稳定和难以透过细胞膜的不足，通过高渗透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect ，EPR ）增加其靶向性，降低了治疗剂量进而提高其体内生物利用度[11-12] 。近年来唾液酸（sialic acid ，SA ）的结合蛋白相继被发现，其中Siglec-1 又被称为唾液酸黏附素[13] ，在巨噬细胞促炎症反应中起着重要作用，已有研究表明其在肿瘤相关巨噬细胞表面高表达[14] ，在肿瘤靶向治疗中可作为抗肿瘤药物的靶点[15] ，将唾液酸修饰在脂质体上，增加制剂靶向效果，可以更好地发挥疗效。

本实验采用改良逆相乙醇注入法制备唾液酸修饰绿原酸脂质体（sialic acid modified chlorogenic acid liposomes ，CA-SAL ），通过响应面设计优化处方制剂工艺，对其形态、粒径及其分布和包封率进行评价，并进一步通过细胞毒性和细胞摄取实验考察了唾液酸修饰绿原酸脂质体的体外抗肿瘤活性。

1仪器与材料

DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，杭州博研仪器设备有限公司；Agilent1200 型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；艾本德5810R 台式离心机，德国Eppendorf 有限公司；超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司；UV-vis2450 紫外分光光度计，日本Shimadzu 有限公司；XS105 分析天平，梅特勒- 托利多有限公司；Nano-zs90 激光粒度Zeta 电势测定仪，英国马尔文仪器有限公司；DS-Ri2 荧光倒置显微镜，日本Nikon 有限公司；Infinite 200 多功能酶标仪，瑞士帝肯有限公司；Nicolet IS50 红外光谱仪，赛默飞世尔科技公司；Avance II600MHz 核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克有限公司。

1.2材料

2方法与结果

2.1SA-ODA的合成[16]

室温下使用DMF 10 mL 溶解唾液酸184 mg （0.60 mmol ），之后加入NHS 140 mg 和EDC·HCl 228 mg ，室温下磁力搅拌1 h 进行活化。活化完成后向反应体系中加入ODA 54 mg （0.20 mmol ），氮气保护下60 ℃、240 r/min 搅拌12 h 。反应完成后用超纯水将反应体系稀释至4 倍体积，并使用超纯水进行充分透析（截留相对分子质量3 500 ），冻干得SA-ODA 纯品。唾液酸和SA-ODA 傅里叶变换红外光谱（FT-IR ）见图1 ，SA-ODA 核磁共振氢谱（1 H-NMR ）见图2 。通过图1 中2 918 、2 850 cm −1 处烷基和1 117 、1 030 cm −1 处醇羟基的存在以及随着1 725 、1 756 cm −1 处羧酸基团的消失，验证了SA 与ODA 的连接。

2.2绿原酸定量分析方法的建立

2.2.1溶液的配制

（1 ）空白脂质体破乳液：精密吸取空白脂质体混悬液0.2 mL，加50%甲醇超声溶解定容至5.0 mL，过0.22 μm微孔滤膜，即得空白脂质体破乳液。

（2 ）绿原酸对照品溶液：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇超声溶解定容至25 mL ，制成绿原酸对照品溶液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得绿原酸对照品溶液。

（3 ）CA-SAL 破乳液：精密吸取CA-SAL0.2 mL ，加甲醇超声溶解定容至5.0 mL ，过0.22 μm 微孔滤膜，即得CA-SAL 破乳液。

2.2.2色谱条件色谱柱为Zorbax SB-C 18 柱（250 mm ×，）；流动相为0.4% 磷酸水溶液- 乙腈（82 ∶18 ）；体积流量1.0 mL/min ；检测波长327 nm ；进样量；柱温25 ℃。

2.2.3专属性考察取空白脂质体破乳液、绿原酸对照品溶液、CA-SAL 破乳液各进样，分别记录高效液相色谱图，在此条件下，绿原酸色谱峰峰形良好，辅料对药物的测定无干扰，见图3 。

2.2.4线性关系考察取绿原酸对照品溶液，分别稀释制成质量浓度为60.48 、120.96 、181.44 、241.92 、302.40 μg/mL 的系列对照品溶液，按“2.2.2 ”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以绿原酸质量浓度为横坐标（X ）、峰面积为纵坐标（Y ）进行线性回归，得线性回归方程Y ＝27.327 X －665.82 ，r ＝0.999 8 ，结果表明绿原酸在60.48 ～302.40 μg/mL 与峰面积线性关系良好。

2.2.5精密度试验取绿原酸对照品溶液重复进样测定6 次，记录峰面积，计算得其RSD 为0.45% ，表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性试验取CA-SAL 破乳液，分别于放置0 、2 、4 、8 、16 、24 h 时进样测定，结果CA-SAL 破乳液绿原酸峰面积RSD 为1.22% ，表明CA-SAL 破乳液24 h 内稳定性良好。

2.2.7重复性试验取同一批CA-SAL 0.2 mL ，平行6 份，置于5 mL 量瓶，用甲醇定容，摇匀，按“2.2.2 ”项下色谱条件进样测定。结果绿原酸平均质量浓度为1.60 mg/mL ，RSD 为2.2% ，表明该方法重复性好。

2.2.8加样回收率试验取“2.2.1 ”项下空白脂质体6 份，每份0.2 mL ，每份分别加入绿原酸对照品溶液（2.03 mg/mL ）0.2 mL ，涡旋混匀，甲醇溶解定容至5 mL ，涡旋混匀，过微孔滤膜，取续滤液，按照“2.2.2 ”项下色谱条件进行测定，结果平均回收率为99.30% ，RSD 为2.71% 。

2.3脂质体包封率的测定方法

选用葡聚糖凝胶柱法进行脂质体与游离药物的分离[17-18] 。取葡聚糖G-50 凝胶用超纯水浸泡充分溶胀后填充于具有2 层滤纸片的2.5 mL 注射器内，待水分自然流下，514 ×g 离心3 min 除去多余水分，即得柱高约3.5 cm 的微柱待用。

精密量取2 份CA-SAL 0.2 mL ，其中1 份加于微型凝胶柱的顶端，514 ×g 离心3 min ，继续加入0.2 mL 超纯水于微型凝胶柱的顶端，514 ×g 离心3 min ，分别连续操作3 次，合并收集离心洗脱液于5 mL 量瓶，用甲醇超声溶解定容，过0.22 μm 微孔滤膜。按“2.2.2 ”项下色谱条件进行检测，测定上柱后的峰面积，计算绿原酸质量浓度（C 离心后）。另1 份加于5 mL 量瓶中，用50% 甲醇超声溶解定容，按“2.2.2 ”项下色谱条件测定上柱前的峰面积，计算绿原酸质量浓度（C 离心前），计算包封率，公式为包封率＝C 离心后/ C 离心前。

2.4脂质体制备方法选择

2.4.1薄膜分散法按课题组前期预实验比例称取脂质体膜材，即HSPC 、胆固醇、SA-ODA 质量比为73 ∶22 ∶5 溶于三氯甲烷中，50 ℃减压蒸发除去有机溶剂，形成均匀脂质膜，加入3 mL 相同温度质量浓度为1.67mg/mL 绿原酸溶液，50 ℃水合20 min 过0.80 、0.45 、微孔滤膜，即得CA-SAL 。

2.4.2改良逆相乙醇注入法按课题组前期预实验比例称取脂质体膜材，即HSPC 、胆固醇、SA-ODA 质量比为73 ∶22 ∶5 ，加入制剂终体积的无水乙醇并于50 ℃水浴中搅拌速度为320 r/min 搅拌溶解。待膜材完全溶解后，继续搅拌，挥去大部分无水乙醇。将预热至相同温度的质量浓度为1.67 mg/mL 绿原酸溶液注入膜材中，50 ℃水浴搅拌20 min ，得到CA-SAL 初品。将初品超声分散处理6 min （功率400 W ，工作1 s 间歇1 s ）后，依次通过0.80 、0.45 、的微孔滤膜，即得CA-SAL 。

2.4.3筛选结果由于薄膜分散法制备的脂质体粒径大、包封率低（表1 ），因此选择改良逆相乙醇注入法。

2.5单因素实验

2.5.1磷脂与药物比例考察固定处方中的药量为5 mg ，设定磷脂与药物的比例分别为5 ∶1 、10 ∶1 、15 ∶1 、20 ∶1 、25 ∶1 ，按“2.4.2 ”项下改良逆相乙醇注入法制备脂质体，结果包封率分别为（28.9 ±1.4 ）% 、（35.9 ±1.2 ）% 、（47.8 ±2.1 ）% 、（45.2 ±3.6 ）% 、（46.3 ±3.4 ）% ，由以上结果可知，包封率随着磷脂与药物比例的增大而增大，但是当磷脂与药物比例达到15 ∶1 时，包封率不再提升，出于成本考虑选择磷脂与药物比例15 ∶1 进行载药。

2.5.2水化温度考察设定水化温度分别为25 、35 、45 、55 、65 ℃，其他条件不变，按“2.4.2 ”项下方法制备脂质体，结果包封率分别为（20.9 ±2.3 ）% 、（30.3 ±1.4 ）% 、（40.6 ±1.1 ）% 、（46.3 ±2.6 ）% 、（44.6 ±2.4 ）% ，由以上结果可知，包封率随着水化温度的升高而增大，但是当水化温度达到55 ℃时，包封率不再升高，反而有所下降。因为当温度升高到相变温度以上磷脂流动性增强，有利于药物包封，而温度过高流动性太强导致药物漏出，对绿原酸的稳定性也会造成影响。在达到相变温度的情况下考虑选择55 ℃为水化温度。

2.5.3水化时间考察设定水化时间分别为20 、30 、40 、50 、60 min ，其他条件不变，按“2.4.2 ”项下方法制备脂质体，结果包封率分别为（45.3 ±1.3 ）% 、（46.7 ±1.2 ）% 、（46.6 ±2.4 ）% 、（40.5 ±2.3 ）% 、（39.6 ±1.6 ）% ，由以上结果可知，包封率在水化时间到达50 min 后有所下降，可能是因为当包封的药物达到饱和，水化时间过长会导致药物泄漏。在药物包封完全的情况下考虑选择30 min 为水化时间。

2.5.4超声功率考察设定超声功率分别为100 、200 、300 、400 、500 W ，其他条件不变，按“2.4.2 ”项下方法制备脂质体，结果包封率分别为（40.5 ±3.1 ）% 、（43.7 ±2.2 ）% 、（45.4 ±2.4 ）% 、（44.5 ±1.3 ）% 、（38.6 ±1.4 ）% ，由以上结果可知，包封率随着超声功率间的增加而增大，但是当超声功率到了300 W 时，包封率不再升高，反而下降，可能是因为超声功率过高导致部分药物泄漏。在考虑超声分散均匀的情况下选择超声功率为300 W 。

2.5.5超声时间考察设定超声时间分别为2 、4 、6 、8 、10 min ，其他条件不变，按“2.4.2 ”项下方法制备脂质体，结果包封率分别为（42.6 ±1.1 ）% 、（45.8 ±3.2 ）% 、（45.4 ±2.1 ）% 、（39.5 ±2.3 ）% 、（35.6 ±1.7 ）% ，由以上结果可知，包封率开始随着超声时间的增加而变化不大，但是当超声时间到了8 min 时，包封率开始出现了明显的下降，可能是因为超声时间过长导致部分药物泄漏。考虑选择超声时间为6 min 。

2.5.6磷脂种类考察分别采用HSPC 、SPC 、EPC 、DSPC 4 种不同的磷脂，其他条件不变，按“2.4.2 ”项下方法制备脂质体，结果包封率分别为（46.4 ±3.1 ）% 、（38.8 ±2.5 ）% 、（39.4 ±1.5 ）% 、（44.4 ±2.8 ）% ，结果表明HSPC 和DSPC 的效果较好。在考虑到HSPC 较为经济的情况下选择磷脂种类为HSPC 。

2.6Box-Behnken响应面法优化脂质体制备工艺及处方

2.6.1响应面实验设计及结果应用Design Expert 12.0 软件进行响应面设计，在前期单因素试验的基础上，以CA-SAL 包封率（Y 1 ）和载药量（Y 2 ）为响应值，影响较为显著的磷脂与药物质量比（X 1 ）、水化温度（X 2 ）、超声功率（X 3 ）3 个因素为考察对象，采取3 因素3 水平响应面优化法，确定最佳制备工艺。考察因素水平、试验设计及结果见表2 。

2.6.2模型的建立及其显著性检验通过Design- Expert 12.0 软件对表2 数据进行拟合，得到方程为Y 1 ＝157.23 －5.06 X 1 －3.94 X 2 －0.12 X 3 ＋0.069 X 1 X 2 ＋8.70 ×10 −3 X 1 X 3 －1.53 ×10 −3 X 2 X 3 －2.50 ×10−3X 1 2 ＋0.037 X 2 2 ＋3.51×10−4X 3 2 ，Y2＝13.35937－0.930 5 X 1 －0.192 25 X 2 －7.725 ×10 −3 X 3 ＋3 ×10 −3 X 1 X 2 ＋5 ×10 −5 X 1 X 3 －1 ×10 −4 X 2 X 3 ＋0.024 9 X 1 2 ＋1.975 ×10 −3 X 2 2 ＋3.225 ×10 −5 X 3 2 。方差分析表见表3 。模型P ＜0.05 ，具有显著性影响，而失拟项P ＞0.05 ，表明失拟不显著。模型的相关系数（r 2 ）分别为0.984 5 、0.991 8 ，调整确定系数（r adj 2 ）分别为0.964 6 、0.981 2 ，该模型与实际试验拟合程度良好，用该模型分析和预测脂质体制备是合适的。

2.6.3响应面分析通过Design-Expert 12.0 软件对各因素之间的交互作用进行响应面分析，绘制响应面曲线图，响应曲面陡峭程度越大，则对包封率和载药量的影响也越大。结果见图4 、5 。

2.6.4最佳工艺的确定和验证期望脂质体包封率和载药量处于最大值为优化指标，通过Design- Expert 12.0 软件分析，最终确定CA-SAL 制备的最佳工艺条件为磷脂与药物质量比为15 ∶1 ，水化温度为60 ℃，超声功率为400 W 。在该条件下CA- SAL 的理论包封率为60.5% ，说明利用建立的模型是合理的。对结果进行验证，重复3 次，CA-SAL 的平均包封率为57.8% ，RSD 为，载药量为2.3% ，RSD 为0.5% ，说明该模型得到的结果可靠。

按照上述CA-SAL 最佳制备工艺制备绿原酸脂质体（CA-CL ），膜材中不加入SA-ODA 。

2.7脂质体理化性质的初步研究

2.7.1脂质体形态的观察本实验制备得到的脂质体均外观澄清透明，呈淡蓝色乳光，结果见图6 。将脂质体混悬液滴入铜网，然后用磷钨酸染色制备样品。然后对样品进行干燥，置于透射电镜下观察。如图7 示，CA-CL 和CA-SAL 均呈类球型，圆整。

2.7.2粒度及Zeta 电位考察将取适量制备的脂质体稀释一定倍数后，于激光粒度分析仪测定粒径、Zeta 电位及多分散系数（PDI ）。测得CA-SAL 的数据。CA-SAL 平均粒径为（90.13 ±0.51 ）nm ，PDI 为0.16 ±0.01 ，Zeta 电位为（−25.3 ±0.5 ）mV 。

2.7.3放置稳定性取制备的脂质体3 批，于4 ℃条件下放置保存，分别于第0 、1 个月取样，观察是否有分层、沉淀现象，考察粒径及包封率变化情况。结果见表4 ，CA-SAL 在4 ℃条件下存放1 个月，有少量沉淀和絮凝产生，经振摇可复原，均匀性良好，包封率和粒径均无显著性变化。结果表明，CA-SAL 在4 ℃条件下稳定性较好。

2.8体外释放

分别取1 mL CA-CL 、CA-SAL 、绿原酸溶液（均含绿原酸4mg ）置入透析袋中，加入释放介质（PBS ，pH 6.8 ）25 mL ，于37 ℃、100 r/min 恒温振荡。分别于0.5 、1 、2 、4 、6 、12 h 取样1 mL （同时补充等温等量释放介质），用HPLC 法测定绿原酸质量浓度，计算3 组样品各时间点累积释药分数并作图。结果如图8 所示，绿原酸溶液在最初释放已达到71.2% ，4 h 时绿原酸溶液的累积释放率为99.8% ，已经基本释药完全。而CA-CL 和CA-SAL 无明显突释现象，在0.5 h 的累积释放率分别为15.6% 、17.8% 。12 h 时，CA-CL 和CA-SAL 的累积释放率分别为60.1% 、58.4% 。综上所述，CA-CL 和CA-SAL 与游离药物相比，具有一定的缓释作用，且二者的释放曲线相似，说明SA 的修饰对药物释放无明显影响。

2.9 CA-SAL的细胞毒性实验

培养A549 细胞并接种于96 孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时，以含10% FBS 的培养基为空白对照组，以未经药物处理过的细胞悬液为阴性对照组，加入3个质量浓度（300、600、900 μg/mL）的游离绿原酸、CA-CL及CA-SAL。继续培养48 h后，采用MTT法检测各组490 nm处吸光度（A ）值，计算细胞存活率，结果见图9。在低质量浓度时CA-CL和CA-SAL对A549细胞没有出现抑制，CA-CL和CA-SAL随着药物质量浓度的增加对A549细胞的增殖抑制率增强。在相同给药浓度下，CA-SAL对A549细胞的增殖抑制作用显著强于CA-CL。

2.10细胞摄取实验

2.10.1香豆素储备液制备精密称取香豆素-6 适量于5 mL 量瓶中，无水乙醇溶解定容至刻度，制成0.6 mg/mL 的香豆素-6 溶液，过0.22 μm 微孔滤膜，即得。

2.10.2载香豆素脂质体（C6-CL ）制备取脂质体膜材HSPC- 胆固醇（10 ∶3 ），加入0.5 mL 香豆素-6 储备液，60 ℃水浴中搅拌溶解。待膜材完全溶解后，继续搅拌，挥除大部分溶剂。将预热至相同温度超纯水注入膜材中，60 ℃水浴搅拌20 min ，得到C6-CL 初品。将初品超声分散处理6 min （功率400 W ，工作1 s 间歇1 s ）后，依次通过0.80 、0.45 、的微孔滤膜，即得C6-CL 。

2.10.3载香豆素唾液酸修饰脂质体（C6-SAL ）制备按质量比73 ∶22 ∶5 称取HSPC 、胆固醇、SA-ODA ，加入0.5 mL 香豆素-6 储备液，60 ℃水浴中搅拌溶解。待膜材完全溶解后，继续搅拌挥除大部分溶剂。将预热至相同温度的超纯水注入膜材中，60 ℃水浴搅拌20 min ，得到C6-SAL 初品。将初品超声分散处理6 min （功率400 W ，工作1 s 间歇1 s ）后，依次通过0.80 、0.45 、的微孔滤膜，即得C6-SAL 。

C6-CL 、C6-SAL 的粒径和PDI 测定结果见表5 。

2.10.4细胞摄取将A549 细胞按照1 ×10 5 / 孔接种于24 孔板中，培养24 h 后弃去培养基，替换为分别含C6-CL 、C6-SAL ，SA ＋C6-SAL 的培养基，于CO 2 培养箱中分别孵育4 h ，弃去培养基，加入适量PBS 清洗3 次，加入2 μg/mL DAPI 溶液，室温孵育20 min ，加冰PBS 漂洗3 次，加4% 多聚甲醛固定15 min ，弃去多聚甲醛，用冰PBS 保存。倒置荧光显微镜观察细胞摄取情况。A549 细胞对各组脂质体的摄取情况见图10 。可以观察到A549 细胞在C6-SAL 和SA ＋C6-SAL 组的荧光亮度明显高于C6-CL 组，SA ＋C6-SAL 组的荧光亮度较C6-SAL 组有所下降，是由于游离SA 的竞争受体减少了A549 细胞对C6-SAL 的摄取。

本实验采用改良逆相乙醇注入法制备绿原酸脂质体，与薄膜分散法所制备的绿原酸脂质体[19-20] 相比其粒径更小分散的更为均匀。

影响CA-SAL 制备的因素有很多，如磷脂种类、药脂比、水化时间、超声时间及功率等，为了考察各因素综合影响，需要进行多因素多水平试验。Box- Behnken 是近年来常用的响应面设计方法[21-22] ，响应面设计可以将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的1 次或2 次多项式模型来拟合，计算比较简便，与正交试验相比，可以在试验条件寻优过程中连续的对试验的各个水平进行分析[23-24] ，得到最优的条件。包封率和载药量是评价脂质体质量的重要指标[25-26] ，绿原酸作为水溶性小分子药物，本身包封率较低[27] ，通过响应面优化制备工艺后，提高了脂质体的包封率。

研究表明绿原酸具有良好的抗肿瘤活性[28] 。本研究将绿原酸制备成脂质体来提高绿原酸的稳定性，并考察其抗肿瘤活性。细胞毒性实验显示，绿原酸脂质体对A549 细胞增殖具有一定的抑制作用，唾液酸修饰后的绿原酸脂质体相比于普通脂质体对A549细胞的抑制作用明显增强。为考察肿瘤细胞对唾液酸修饰绿原酸脂质体的摄取能力，以香豆素-6为荧光标记来显示唾液酸修饰前后的脂质体的体外摄取。细胞摄取实验结果显示，C6-SAL组的荧光强度明显强于C6-CL组，其与细胞毒性实验结果一致。而通过竞争抑制实验，验证了C6-SAL摄取的增加是由于唾液酸的修饰，从结果可知与C6-SAL相比，C6-SAL＋SA组的细胞摄取显著减少，这可能是因为唾液酸的预先过饱和孵育结合了A549细胞上的唾液酸受体，导致SA修饰脂质体无法利用表面修饰的唾液酸与细胞表面的受体进行配体-受体介导的特异性反应增加其细胞摄取。

综上所述，本研究通过响应面优化制备了粒径小、稳定性好的唾液酸修饰的绿原酸脂质体，并具有一定的体外抗肿瘤活性。在后期实验研究中将进一步考察其体内的药效学以及体内靶向能力。

参考文献（略）