产谷胱甘肽毕赤酵母工程菌的构建及能量调控

谷胱甘肽(glutathione, GSH)是一种三肽活性物质,广泛存在于动物、植物和微生物中,具有保护和调节细胞内氧化还原平衡的作用[1]。GSH相对分子质量为307.33,由谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸组成,在各种生物的体内含量各不相同,其中在酵母和动物内脏中含量较高。GSH在肝病、肾病以及心血管疾病上都具有显著的疗效[2]。GSH的主要特征是其具有一个γ酰胺键和一个巯基基团。在大多数原核和真核生物中由两步反应生成,第一步由谷氨酸和半胱氨酸在谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的作用下生成谷氨酰半胱氨酸,之后该产物再与甘氨酸在谷胱甘肽合成酶(GS)的作用下反应生成GSH,第一步反应的酶是生成GSH的关键酶,受产物的反馈抑制,两步酶皆是ATP依赖型,反应均需消耗1分子的ATP[3]。

目前,GSH合成方法有化学合成法、酶转化法和发酵法。化学合成法采用3种前体利用化学工艺合成GSH,成本高昂且对环境造成污染[4]。酶法采用3种前体、ATP及酶反应生成GSH,此法核心是筛选出具有高活性的合成酶,但成本高[5-7]。发酵法是微生物利用廉价的原料生产积累高浓度的GSH,然后分离纯化,成本低、纯度高、无污染,是目前生产GSH的主要方法[8]。通常采用诱变或者基因工程来提高酶的活性,或通过优化发酵条件提高前体的利用[9-11]。由于酵母中GSH含量较高,遗传背景清晰,所以经常被用作生产GSH的优良宿主。半胱氨酸是提高GSH的关键氨基酸，但在进行高密度发酵生产时,细胞通过代谢合成的半胱氨酸远不能满足GSH合成的需要[10]。因此,外源添加半胱氨酸是一种有效策略,也确实实现了GSH的大规模生产[12]。然而当半胱氨酸添加过量时,使得充当能量载体的ATP成为GSH生产的限制因素。

为解决此问题,研究人员通过在培养基中直接添加能量代谢底物或是通过代谢改造提高胞内ATP的再生来提高胞内GSH或是其余高耗能生物产物的积累[13-16]。GSH的合成一个巨大的耗能反应,高密度发酵的方式使ATP成为关键的限制因素。毕赤酵母是重组蛋白表达的优良宿主,由于其较易实现高密度发酵且具有食品安全级状态,近些年来常用作生产高附加值产物。本实验为获得高产GSH的毕赤酵母菌株,通过在毕赤酵母GS115中异源表达来自酿酒酵母的Scgsh1(编码γ-GCS)和Scgsh2(编码GS)以增强其合成路径,在添加前体物质的条件下获得了GSH的过量积累,之后对辅能量底物柠檬酸钠的条件进行了优化,并进行放大发酵验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒及引物

菌株：Pichia pastoris GS115、Saccharomyces cerevisiae BY4741、质粒扩增保藏菌株Escherichia coli JM109。均来自实验室，-80 ℃保藏。

质粒和引物：pPIC3.5K来自本实验室保藏,构建所用质粒皆为本课题组在此基础上构建。Scgsh1基因(Gene ID:853344)和Scgsh2基因(Gene ID:854108)经S.cerevisiae BY4741基因组PCR扩增后获取,载体构建成功后的阳性转化子经提取质粒送去天霖生物科技有限公司测序验证,测序结果与NCBI上序列一致的重组质粒将用于后续菌株的构建。所用引物皆为金唯智生物科技公司合成,如表1所示。

表1 本研究中所用引物序列
Table 1 Primers used in this study

1.1.2 酶和试剂

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒,上海捷瑞生物技术有限公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶,Takara公司；ATP含量测定试剂盒,碧云天生物技术。

1.1.3 培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10,酵母膏5,NaCl 10；固体另加2 g/L的琼脂。

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20,酵母膏10,蛋白胨20；固体另加2 g/L的琼脂。

MD培养基(g/L)：葡萄糖20,YNB 13.4；固体另加2 g/L的琼脂。

种子培养基为YPD培养基,摇瓶水平的发酵培养基为YPD培养基。

YPDZ培养基(g/L)：在YPD培养基的基础上,加入Zeocin使之质量浓度为100 μg/L。

上罐培养基(g/L)：葡萄糖 50,酵母粉 5,(NH4)2SO4 11,K2HPO4 7,MgSO4 5,CaCl2 0.5,KCl 0.5。

1.2 实验方法

1.2.1 质粒构建方法

构建以PGAP为启动子、TAOX1为终止子的组成型表达菌株。首先以GAP-F/GAP-R为引物扩增出基因组上的PGAP启动子序列。采用Sac I及BamH I酶切pPIC 3.5K以去除PAOX1片段并用PGAP序列代替得到组成型表达的质粒,将其命名为pPICKT。以S.cerevisiae BY4741的基因组为模板,分别以GSH1F/GSH1R、GSH2F/GSH2R PCR扩增出目的基因Scgsh1和Scgsh2片段连接至pPICKT中,构成P1和P2质粒。后用G1F/G1R和TF/TR分别扩增P1质粒上的PGAP-Scgsh1与TAox1片段,后采用诺唯赞C113多片段同源重组连接试剂盒连接入P2质粒中,获得同时含有Scgsh1和Scgsh2表达单元的质粒pP-PGAP-Scgsh1-Scgsh2,即P3质粒。以上构建质粒过程均转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,在含有100 mg/L的氨苄青霉素LB抗性平板上进行筛选,获得的转化子经菌落PCR验证及测序,得到正确的转化子。

1.2.2 电转化及筛选方法

将质粒pP-PGAP、P1及P3均用Sal I线性化后采用根据手册(Invitrogen)通过电转法将线性化质粒转化至毕赤酵母,涂布于含有组氨酸缺陷型的MD平板,于30 ℃下孵育2～3 d。将长出的菌落点至高质量浓度G418(4 mg/mL)中,长出的较大的菌落并提交基因组验证后即可获得含有高拷贝基因数的目的菌株。

1.2.3 培养方法

摇瓶发酵：种子培养基及发酵培养基均为YPD培养基。将菌株从甘油管挑至YPD平板上划线,30 ℃培养2～3 d,长出的单菌落挑至含有10 mL种子培养基的摇瓶中,30 ℃培养16～18 h,之后以适当的浓度接种至发酵培养基中培养。

发酵罐发酵：将种子培养基培养16～18 h,以体积分数为10%的接种量接入100 L发酵罐中。待培养基pH降至5.5时,流加50%氨水使发酵过程的pH始终维持在5.5。1 L培养基中含有10 mL PTM1,待初始培养基中的糖降至5 g/L时,补加700 g/L的葡萄糖,使乙醇质量浓度始终在3 g/L以下。当发酵液OD600达到250,即发酵48 h时,投料终浓度为10 mmol/L氨基酸前体混合液。定时取样,测生物量、GSH质量浓度、甘油、还原糖及乙醇质量浓度。

1.2.4 发酵产物检测方法

生物量检测：取适量检测点的样品稀释至OD600值为0.2～0.8,于600 nm处测取吸光度。

GSH提取及检测：将发酵液进行12 000 r/min离心2 min以收集菌体。超纯水振荡悬浮2次以去除培养基的影响。采用40%乙醇提取,30 ℃ 220 r/min振荡孵育2 h,8 000 r/min离心5 min,即得到富含GSH的上清液。GSH的检测采用Alloxan法[17]。

ATP含量检测：取适量16、20、24和28 h样品,离心后用pH 6的Tris-HCl溶液振荡悬浮2次,超声破碎,上清液采用ATP检测试剂盒检测ATP[18]。

甘油、乙醇、还原糖检测：离心后的上清液用SBA-40D检测乙醇质量浓度,使用西尔曼生物传感器测甘油含量。

2 结果与分析

2.1 Scgsh1单独表达及Scgsh1与Scgsh2共表达对毕赤酵母积累GSH的影响

2.1.1 酿酒酵母Scgsh1和Scgsh2的克隆

为获得酿酒酵母谷氨酰半胱氨酸合成酶基因Scgsh1及谷胱甘肽合成酶基因Scgsh2,以酿酒酵母BY4741基因组为模板进行PCR扩增,结果如图1-a、图1-b所示。产物回收后送至天霖生物科技有限公司测序,测序结果与NCBI上序列(Gene ID:853344、Gene ID:854108)进行比对,序列完全一致,因此得到Scgsh1和Scgsh2的基因序列,按照1.2.1小节进行菌株构建。

2.1.2 重组毕赤酵母的构建

将pPIC3.5KT、pPIC3.5KT-Scgsh1、pPIC3.5KT-Scgsh1-Scgsh2线性化电转至GS115中,使其整合在his4基因处,将其分别命名为G1、G2、G3。由于整合至基因组的质粒带有卡那抗性基因而使目的菌株带有G418抗性,且随着整合拷贝数的增加,菌株抗G418的能力越强。为此,将在组氨酸缺陷型平板上长出的单菌落点板至高质量浓度的G418(4 mg/mL)中,长出的转化子经提基因组验证正确后即为目的菌株。提取高抗G418菌株的基因组,分别采用YZGF、YZGR和YZGGF、YZGGR引物验证,验证结果如图1-c、1-d所示,从NCBI数据库得知Scgsh1和Scgsh2大小分别为2 037和1 476 bp,采用设计的验证引物从G2、G3基因组PCR理论应得到2 240 bp和2 964 bp片段,电泳结果证明基因已整合入基因组中。

2.1.3 重组菌发酵特性评价

对GS115、G1、G2、G3进行摇瓶发酵,结果如图2所示。从菌株生长来看,菌株皆在20 h达到稳定期。G1、G2、G3最高生物量较对照GS115分别提高6%、5.61%、10.7%,可能的原因是质粒的整合弥补了GS115组氨酸缺陷的影响,且毕赤酵母在好氧发酵过程中胞内氧化压力较大,GSH的过量合成也可协调胞内的氧化还原平衡。工程菌G2、G3在30 h的产量达到最高,G2菌株在发酵30 h 后的GSH质量浓度为(120.47±0.61) mg/L,相较于GS115(61.52±0.31) mg/L提高了1.95倍。G3菌株发酵30 h后的 GSH质量浓度为(141.96±2.15) mg/L,产量相较对照提高2.31倍。工程菌GSH在细胞内的得率也获得提高,G2、G3 最高达到4.48和5.07 mg/OD,较对照GS115(2.52 mg/OD)分别提高1.77倍和2.01倍。相比G2菌株而言,G3菌株GSH产量的提高幅度有限,其一可能是由于Scgsh1编码的γ-GCS是GSH合成过程中的关键酶,对GSH的合成起决定性作用,GSH的过量积累会对其造成反馈抑制[19]。其二可能是胞内3种前体的供应不足,导致GSH的合成效率受限。

为提高GSH的合成效率,在发酵0 h时添加了终浓度为10 mmol/L的甘氨酸、半胱氨酸和谷氨酸的混合液。从图2-d中可以看出氨基酸前体的加入对菌株生长有一定抑制作用,可能是前体物质中的半胱氨酸对菌株有毒害作用所致,但前体的加入确实极大程度提高了菌体合成GSH的能力,这也与文献报道的一致[20]。在发酵30 h,G2、G3菌株产量分别达至(261.66±21.7)和(302.27±5.06)mg/L,较对照(104.96±3.19) mg/L分别提高2.49倍和2.88倍,且G3菌株胞内GSH得率提升至11.79 mg/OD,故以G3为目的菌株做后续实验。

2.2 辅能量底物柠檬酸钠对G3菌株积累GSH的影响

外源添加氨基酸前体是提高GSH产量有效手段,且上面实验结果也已证实。但外源氨基酸前体的过量添加会使得ATP成为主要的限制性因素。从外源直接添加不失为一种有效手段,但对于工业上的放大发酵是不经济的。在这里,我们外源添加廉价的辅能量底物柠檬酸钠,探究能量对菌体合成GSH的影响,结果如图3-a、3-b所示。

柠檬酸钠的加入对G3菌株的生长无明显影响,对于菌株发酵产GSH有促进作用,对柠檬酸钠的添加时间及质量浓度进行优化,确定最佳添加时间为12 h,添加质量浓度为4 g/L,产量由(308.97±5.51) mg/L提升至(371.12±8.47) mg/L,提升20.1%,得率最高可达到14.41 mg/OD,较添加前提高13.41%。

之后探究了柠檬酸钠添加后对胞内ATP含量的影响,结果如图3-c所示,添加柠檬酸钠后菌株16～28 h内胞内的ATP的含量均比对照要高,这是由于柠檬酸钠的加入,强化了三羧酸循环路径,从而提高胞内ATP的含量。其中在ATP含量20 h达到了最高值,之后迅速下降,这可能是由于在此时期菌体生长进入平台期,此时大量的GSH被合成,消耗了大量的ATP。综上,摇瓶中柠檬酸钠的添加在一定程度上解除了氨基酸过量情况下ATP不足的限制。

2.3 重组菌株上罐发酵验证

为进一步提高GSH产量,作者在100 L发酵罐的培养条件下开展了毕赤酵母工程菌的罐上发酵实验。由于氨基酸前体溶液的添加对菌株生长有一定抑制作用,在这里采用补料分批发酵的方式先提高菌体生物量后单次补加前体混合液的两阶段合成GSH。发酵结果如图4所示,全程控制乙醇含量调控补料速率,使乙醇含量始终在3 g/L以下。

图4 G3菌株在100 L发酵罐水平的发酵性能
Fig.4 Fermentation profile of G3 in 100 L fermentor

酵母发酵产2,3-丁二醇时,甘油是作为NAD+再生的主要副产物存在[21]。GSH是胞内的协调氧化还原平衡的物质,为此,我们在发酵过程中检测甘油的含量,发酵液中甘油的含量始终在0.3 g/L,也就是说甘油并不是GSH合成时的主要副产物。G3菌株菌体生物量在40 h处于对数生长后期,在48 h到达生长稳定期,此时的生物量OD600达到257,较摇瓶发酵水平的生物量OD600(28.4)提高9.05倍,同时葡萄糖在16 h时被迅速消耗尽,剩余量为0.36 g/L。GSH作为初级代谢产物伴随菌体生长积累,在投料氨基酸前体混合液之前在48 h达到728 mg/L。在此时投料氨基酸溶液,GSH的合成效率迅速增加,在68 h时GSH的产量达至最高为2 000 mg/L,较摇瓶水平最高产量(302.27 mg/L)提高了6.62倍。以上结果显示,两阶段合成法对促进GSH的产生有显著作用。WANG等[20]通过控制呼吸熵优化葡萄糖的补料速率,实现生长与合成分开,使GSH含量显著提高,本文的研究结果也与之相似。

3 结论

巴斯德毕赤酵母作为蛋白质表达的强大系统而受到广泛的关注。除蛋白质外,近些年还用于生产其他增值产品,例如类胡萝卜素、维生素K2等等,从而证明了巴斯德毕赤酵母从单个基因的有效表达已扩展到合成途径的表达,以生产附加值高的化合物[22-23]。本研究以毕赤酵母GS115为宿主菌株,异源整合表达来源于酿酒酵母BY4741的Scgsh1及Scgsh2基因,从而强化了GSH在毕赤酵母中的合成路径,再添加前体氨基酸的条件下使GSH的产量由(104.69±3.19) mg/L提升至(302.27±5.06) mg/L,且细胞内的得率也大幅提高。之后为减轻氨基酸前体过量时能量的限制,采用添加辅能量底物柠檬酸钠的策略,GSH产量进一步提升至(371.12±8.47) mg/L。为进一步提高GSH产量,采用了100 L发酵罐的放大发酵,并控制乙醇质量浓度优化补糖速率,进而使OD600最高可达至257,最高产量可达2 000 mg/L,较摇瓶水平分别提高9.05倍和6.62倍。综上可以看出GSH合成路径的强化及能量供应对提升菌体内GSH的积累具有显著作用,同时也为内源性代谢改造提升胞内能量供应促进GSH积累提供了思路和理论基础。但本研究尚未解除GSH过量积累对谷胱甘肽合成酶系的反馈抑制,今后将着重探究调控胞内能量代谢及解除GSH对胞内合成酶系的反馈抑制对GSH积累的影响。

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DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.025672

引用格式:高宇豪,吴勇杰,朱亚鑫,等.产谷胱甘肽毕赤酵母工程菌的构建及能量调控[J].食品与发酵工业,2021,47(7):21-26.GAO Yuhao,WU Yongjie,ZHU Yaxin, et al.Construction and energy regulation of engineered glutathione-producing Pichia pastoris[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(7):21-26.

第一作者：硕士研究生(徐国强副教授为通讯作者，E-mail：xuguoqiang@jiangnan.edu.cn)

基金项目：江苏省自然基金面上项目(BK20191333)

收稿日期：2020-09-15,改回日期：2020-10-14