类胡萝卜素是一组1100多种天然脂溶性色素分子，不仅可以用作天然着色剂，且具有促进健康的功效，在制药、食品、饲料和化妆品行业中已经有广泛的应用。人类无法合成类胡萝卜素，因此必须在食物中补充这些化合物。
粘红酵母ZHK是一种含油脂的红酵母，主要生产三种类胡萝卜素：圆酵母素、红酵母红素和β-胡萝卜素。相较于β-胡萝卜素，圆酵母素、红酵母红素的研究较少，近期有研究表明这两种类胡萝卜素具有很强的抗氧化性能、且表现出较强的维生素A原和抗前列腺癌活性。因此进一步提高圆酵母素和红酵母红素的产量具有商业应用价值。
尽管有大量的文献介绍了环境因素对粘红酵母中圆酵母素和红酵母红素生物合成效率的影响，但盐胁迫的具体作用尚未研究。因此，本研究的主要目的是通过对转录组和代谢组的综合分析，研究盐胁迫对粘红酵母ZHK产生圆酵母素和红酵母红素的影响，并确定其分子机制。
研究方法
1、酵母培养条件：分别用浓度为0.5、0.75和1.0 M的NaCl培养粘红酵母ZHK，生长周期为120 h。在接种前加入终浓度为40 μM的二苯胺(DPA)以抑制胡萝卜素的生成。
2、测定指标：活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）
3、组学手段：转录组测序、代谢组学分析
实验结果
1、盐胁迫对粘红酵母ZHK生长的影响
为了揭示不同NaCl浓度对粘红酵母生长的影响，分别在0、0.5、0.75、1.0和1.5 M NaCl浓度下培养粘红酵母ZHK。为进一步研究类胡萝卜素在黏菌ZHK耐盐性中的作用，在培养基中选择性添加40 μM类胡萝卜素生成抑制剂DPA。结果表明，添加DPA后，总类胡萝卜素产量由1.42 mg/L降低至0.16 mg/L。另外如图1所示，NaCl处理显著抑制了粘红酵母ZHK的生长。此外在0.5、0.75、1.0和1.5 M NaCl浓度下，添加40 μM DPA均导致了显著的生长抑制(图1 B−E)。
该结果初步表明，细胞内类胡萝卜素的合成有助于缓解高盐对粘红酵母ZHK的胁迫。
图1
2、盐胁迫对细胞内ROS、SOD和CAT的影响
以往研究表明，在盐胁迫下，ROS的稳态会被打破，同时第一抗氧化机制，如SOD和CAT，则会被激活。为研究盐胁迫下类胡萝卜素合成与抗氧化反应的关系，在选择性添加40 μM DPA的条件下，分别于0.75 M NaCl和、0 M NaCl培养基培养ZHK菌株120 h，然后检测各组间细胞内ROS、SOD、CAT水平的变化。结果如图2所示，与对照组相比，0.75 M NaCl处理显著提高了细胞内ROS、SOD和CAT水平。在0.75 M NaCl处理下，添加40 μM DPA后，细胞内ROS、SOD和CAT水平均显著高于未添加DPA的水平。ROS、SOD或CAT水平与类胡萝卜素合成呈负相关。
这些结果表明，类胡萝卜素可能通过淬灭活性氧，在减轻由盐胁迫引起的抗氧化反应和氧化损伤方面发挥重要作用。
图2
3、盐胁迫对类胡萝卜素含量的影响
采用高效液相色谱法（HPLC）研究了盐胁迫对培养120h后粘红酵母ZHK类胡萝卜素含量的影响（图3）。
从产量变化看，对于总类胡萝卜素而言，与对照相比，其产量在0.5 M和0.75 M NaCl处理中显著增加，而在1.0 M NaCl处理中显著降低；红酵母红素和β-胡萝卜素产量的情况与之类似；而对于圆酵母素而言，0.5 M和0.75 M NaCl处理使其产量显著增加，而1.0 M NaCl处理下的产量无明显变化。该结果证明，在中等盐条件下，粘红酵母的圆酵母素、红酵母红素产量较高。
而从三种类胡萝卜素占比来看，0.5 M、0.75 M和1 M NaCl处理下圆酵母素在总类胡萝卜素中的相对比例均显著高于对照；然而，与对照相比，当暴露在盐胁迫下时，红酵母红素的比例却逐渐下降；β-胡萝卜素的情况与之类似：0.5和0.75 M NaCl处理虽然提高了β-胡萝卜素的产量，但显著降低了其在总类胡萝卜素中的相对比例。
综上所述，中度盐胁迫(0.5和0.75 M)可显著增加粘红酵母的类胡萝卜素产量，尤其是圆酵母素和红酵母红素。
图3
4、 响应盐胁迫的差异表达基因
为了鉴定在0.75 M NaCl胁迫下粘红酵母ZHK中的差异表达基因，进行转录组测序，结果表明，与对照相比，盐胁迫下共有1829个基因发生表达差异，其中840个基因表达上调，989个基因表达下调。特别地，差异基因中检索到与胡萝卜素合成相关的基因（图4 C）：atoB、FDPS、crtE、crtI等，此外，启动子分析显示（图4 D），atoB、FDPS和crtI在其启动子中被发现含有转录因子SP1的共同序列基元(GCCCCKCCCCC)，这些胡萝卜素基因可能受到同一转录因子SP1的调控。
进一步对差异基因进行富集分析。GO富集分析结果显示（图4 A），在CC类别中，富集程度最高的三个GO条目分别是甘露糖基转移酶复合物(GO:0031501)、微体部分(GO:0044438)和过氧化物酶体部分(GO:0044439)；在BP类中，GO条目显著富集的前三个阶段分别是硫化合物代谢过程(GO:0006790)、二羧酸代谢过程(GO:0043648)和有机羟基化合物代谢过程(GO:1901615)；在MF类别中，富集程度最高的GO条目分别是金属簇结合(GO:0051540)、铁-硫簇结合(GO:0051536)和受体结合(GO:0005102)。
KEGG富集分析结果显示（图4 B），盐胁迫下的DEGs在328条通路中富集。与耐盐性相关的途径主要归为氨基酸代谢和碳水化合物代谢，如“苯丙氨酸代谢(ko00360)”、“酪氨酸代谢(ko00350)”、“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢(ko00250)”等。
图4
5、盐胁迫下代谢产物的差异积累
为评估盐胁迫下代谢变化的概述，使用LC - MS/MS进行了代谢组学分析。主成分分析(PCA)和PLS-DA模型显示ST（盐处理）组和CK组相互分离(图5 A、B)。基于MS2谱数据库的分析显示所有样品之间共注释了497个代谢物。其中差异累积代谢物96个，上调代谢物54个，下调代谢物42个(图5 C)。
然后对差异积累代谢物进行KEGG富集分析（图5 D）。结果显示，盐胁迫下的差异积累代谢产物富集到34条通路，值得注意的是，代谢组中最显著富集的KEGG通路与转录组结果高度一致，均属于氨基酸代谢和碳水化合物代谢大类。
最后进行转录-代谢联合分析，利用Pearson相关系数>0.99和p-value <0.01两个标准来构建网络图（图5 E）。结果显示，在盐胁迫响应中，有71个差异表达基因(29个上调，42个下调)和29个差异积累代谢物(17个上调，12个下调)密切相关。其中，差异基因：R. glutinis_g05971、R. glutinis_g03041、R.glutinis_G05970、R. glutinis_g06656、R. glutinis_G03640以及差异积累代谢物：ADP、L-谷氨酸、丙酮酸、谷胱甘肽、二氢玉米素、L-谷氨酰胺，可能在盐胁迫反应中起中枢调控作用。
图5
总结
▶本文研究了不同盐条件对粘红酵母胡萝卜素产量的影响。
▶结果表明，在培养120 h后，中度盐胁迫(0.5和0.75 M NaCl) 处理的类胡萝卜素总量显著高于高度盐胁迫（1.0 M NaCl)和对照。
▶其中，圆酵母素和红酵母红素的增加是类胡萝卜素总量增加的主要原因。
▶转录组分析表明，盐胁迫可有效促进crtI基因的表达，这可以解释盐胁迫下类胡萝卜素和红酵母红素产量增加的分子机制。
▶进一步的实验表明，类胡萝卜素、红酵母红素在抑制盐胁迫引起的异常活性氧中起重要作用。
▶本研究结果为通过基因操作提高粘红酵母耐盐性、进一步提高产圆酵母素、红酵母红素合成效率奠定了理论基础。
