1(浙江工业大学，浙江省生物有机合成技术研究重点实验室，浙江 杭州，310014) 2(生物转化与生物净化教育部工程研究中心(浙江工业大学)，浙江 杭州，310014)
摘 要 以选育产S-腺苷蛋氨酸的高产酿酒酵母菌株为目标，利用常温常压等离子体和137Cs γ-射线对菌株进行诱变。通过5轮常温常压等离子体诱变和4轮γ-射线诱变，结合乙硫氨酸、制霉菌素抗性筛选，获得突变株AC-10，摇瓶发酵48 h，其S-腺苷蛋氨酸产量达到1.15 g/L，与出发菌株相比提高了130.0%。摇瓶发酵最适条件为30 ℃、初始pH 5.5。经5 L发酵罐分批补料发酵68 h，S-腺苷蛋氨酸产量达到5.62 g/L。
关键词 S-腺苷蛋氨酸；酿酒酵母；诱变选育
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.024211
引用格式:秦海彬,牛坤,王远山.产S-腺苷蛋氨酸酵母菌的诱变选育[J].食品与发酵工业,2020,46(21):23-27.QIN Haibin,NIU Kun,WANG Yuanshan.Breeding of S-adenosylmethionine-producing yeast by mutagenesis[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(21):23-27.
Breeding of S-adenosylmethionine-producing yeast by mutagenesis
QIN Haibin1,2,NIU Kun1,2,WANG Yuanshan1,2*
1(Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Pro ince，Zhejiang Uni ersity of Technology，Hangzhou 310014，China) 2(Engineering Research Center of Biocon ersion and Biopurification of the Ministry of Education，Zhejiang Uni ersity of Technology，Hangzhou 310014，China)
ABSTRACT Atmospheric and room-temperature plasma (ARTP) mutagenesis and 137Cs γ-ray mutagenesis were used to mutate an S-adenosylmethionine (SAM)-producing Saccharomyces cere isiae. After fi e runs of ARTP mutagenesis and four runs of γ-ray mutagenesis coupled with ethionine and nystatin-resistant screening, a high SAM producing mutant AC-10 was obtained. The SAM yield reached 1.15 g/L after 48 h flask fermentation, which was 130% higher than that of the original strain. The flask fermentation conditions were further optimized with the optimal temperature and initial pH of 30 ℃ and 5.5, respecti ely. The SAM titer by mutant AC-10 reached 5.62 g/L after 68 h in a 5 L fed-batch fermentation.
Key words S-adenosylmethionine; Saccharomyces cere isiae; mutagenesis screening
第一作者：硕士，工程师(王远山教授为通讯作者，E-mail：yuanshan@zjut.edu.cn)
基金项目：浙江省教育厅一般项目(Y201838987)；浙江省自然科学基金面上项目(LY17C010005)
收稿日期：2020-04-14，改回日期：2020-05-20
S-腺苷蛋氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)存在于各种生物组织内，具有广泛的生物学功能[1]，参与体内蛋白质、核酸、多糖、磷脂以及脂肪酸等物质的生物合成[2-3]。SAM作为标准药物的替代品对治疗抑郁症、骨关节炎、酒精性肝病和阿尔兹海默病具有相当大的优势，市场需求巨大[4]。
SAM的生产方法主要有化学合成法、酶促转化法和微生物发酵法，其中化学法合成产率低，反应底物L-半胱氨酸价格昂贵，且分离与纯化过程困难，难以工业化应用[5]。酶促转化法需要SAM合成酶并添加价格昂贵的底物ATP，因其生产投入较高而缺乏市场竞争力。发酵法生产SAM具有工艺流程简单、产量高、底物廉价易得等优势而被广泛应用[6]。目前，已报道生产SAM的微生物主要有大肠杆菌(Escherichia coli)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomyces cere isiae)。通过同源或异源过表达SAM合成酶可以提高大肠杆菌SAM产量，但是过多的SAM积累不利于菌体生长。重组毕赤酵母生产SAM需要甲醇作为诱导剂，可能引起安全问题，并且发酵周期长。与上述2种微生物相比，酿酒酵母作为安全生物广泛应用于食品与发酵行业，且SAM合成能力强，适宜作为SAM工业生产的菌株[7]。
在传统的产SAM菌株选育方面，SHIOZAKI等[8]筛选到1株野生酿酒酵母，在最适条件下通过发酵罐培养，SAM产量达到10.8 g/L，这是迄今在野生菌发酵产SAM方面最高的报道。利用化学诱变(NTG、EMS、LiCl等)、物理诱变(60Co γ-射线、U 等)以及复合诱变筛选SAM产菌株高也有较多报道，HUANG等[9]利用太空育种方法获得酿酒酵母突变株H5M147，SAM产量达到1.22 g/L，是原始菌株的1.87倍。CAO等[10]用紫外连续诱变结合乙硫氨酸抗性筛选的方法，得到SAM高活性合成酶的酿酒酵母CGMCC2842，与出发菌株相比SAM产量增加了2.7倍，同时在15 L发酵罐中分批补料发酵36 h后SAM产量达到6.1 g/L。为获得SAM高效生产菌株，本实验拟采用常温常压等离体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)和137Cs γ-射线诱变结合乙硫氨酸、制霉菌素抗性平板筛选，并通过摇瓶培养条件优化，5 L发酵罐分批补料发酵，为发酵法生产SAM奠定基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要材料、试剂与仪器
Saccharomyces cere isiae ZY由本实验室保藏。SAM标准品、乙硫氨酸、制霉菌素、生物素、泛酸钙、维生素B1、维生素B6,阿拉丁公司;其他试剂为国产分析纯。
ARTP-II型等离子体诱变仪，无锡源清天木生物科技有限公司；Waters 1525高效液相色谱，美国WATERS公司；spectraMax M5酶标仪，美国分子仪器公司；5 L BIOTECH发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司。
1.1.2 培养基
种子培养基(g/L)：蛋白胨 20，酵母粉 10，葡萄糖 20，pH自然。固体培养基再加入20 g/L琼脂粉，115 ℃灭菌30 min。
摇瓶发酵培养基(g/L)：葡萄糖 30，酵母粉 5，(NH4)2SO4 5，K2HPO4 5，KH2PO4 10， MnSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.1，MgSO4 0.2，CaCl2 0.1，CuSO4 0.001 6，柠檬酸三钠二水合物 0.1，pH自然，115 ℃灭菌30 min。
发酵罐发酵培养基(g/L)：葡萄糖 20，酵母粉 3，(NH4)2SO4 5，K2HPO45，KH2PO4 10， MnSO4·7H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.6，MgSO4 3，CaCl2 0.5，CuSO4 0.001 6，钼酸铵 0.004 8，NaCl 0.5，生物素 0.000 3，泛酸钙 0.003 6，维生素B1 0.003 6，维生素B6 0.003 6。115 ℃灭菌30 min。
发酵罐流加培养基(g/L)：葡萄糖 500，酵母粉12。
1.2 实验方法
1.2.1 培养方法
(1)菌种活化及种子培养。取菌种甘油管涂布于固体培养基平板，30 ℃培养2～3 d，挑取单菌落接入装有10 mL种子培养基的试管中， 30 ℃，150 r/min培养12 h。活化结束后以2%的接种量接入装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，30 ℃，150 r/min培养12 h。
(2)摇瓶发酵培养。250 mL摇瓶中装液量为50 mL摇瓶发酵培养基，以4%(体积分数)的接种量接种，30 ℃，150 r/min摇床中培养24 h，补加2 mL 36 g/L L-蛋氨酸，继续培养24 h。
(3)5 L发酵罐补料发酵
发酵罐装液量为3 L，经过空消、实消灭菌后，种子培养基以10%(体积分数)接种到发酵罐中。控制温度、pH，罐压调控在0.05 MPa，以200 r/min的搅拌速度开始发酵，发酵全程通过控制搅拌转速与葡萄糖流加速度，使溶氧保持在10%～20%，最高转速为750 r/min。发酵过程中每隔2～3 h取样，测定还原糖、菌体量、SAM含量等参数。
1.2.2 诱变方法
(1)ARTP诱变。试验工作气体为氦气，工作气流量为8 SLM，处理距离为2 mm，电源输出功率为120 W。将培养6～8 h的菌体适当稀释后制备菌悬液，取5 μL菌液加5 μL 10%的甘油均匀涂于载片，80%～90%致死率剂量照射。照射后用无菌培养基清洗载片，洗液适当稀释涂布筛选平板上，30 ℃恒温培养箱中培养1～2 d，选择较大单菌落进行发酵培养。
致死率/%=
(1)
(2)137Cs γ-射线诱变。在浙江省农业科学院辐照中心进行，将培养6～8 h的菌体适当稀释后制备菌悬液，80%～90%致死率剂量照射。照射后的菌液经适当稀释处理涂布筛选平板，30 ℃培养1～2 d，选择较大单菌落进行发酵培养。
1.2.3 突变株筛选方法
(1)ARTP诱变与乙硫氨酸抗性平板筛选。蛋氨酸在SAM合成酶与ATP的作用下转化为SAM，但在蛋氨酸类似物如乙硫氨酸的存在下该反应会被抑制，使用乙硫氨酸筛选高耐受突变株，有利于SAM产量的提高[11]。本实验将ARTP照射后的菌液适当稀释后涂布于0.4 mmol/L乙硫氨酸筛选平板，30 ℃培养1～2 d，选择较大单菌落进行发酵培养。
(2)137Cs γ-射线诱变与制霉菌素抗性平板筛选。SAM是酵母菌合成麦角固醇的主要甲基供体且消耗量大，而制霉菌素能够结合酵母菌细胞膜上的麦角固醇，导致麦角固醇产生途径缺失，细胞膜通透性改变。理论上，制霉菌素可以用来选育高产SAM菌株[12]。将γ-射线照射后的菌液进行适当稀释涂布于5 μg/mL制霉菌素筛选平板，30 ℃培养1～2 d，选择较大单菌落进行发酵培养。
1.2.4 测定方法
(1)生物量测定。菌体干重(dry cell weight，DCW)的测定：烘干至恒重的离心管称重(m1)，加入固定体积的发酵液，10 000 r/min离心5 min，弃上清液，用蒸馏水清洗后离心，重复2次。然后85 ℃烘干至恒重后称重(m2)，m2-m1为菌体干重，经换算可得每升发酵液的菌体干重。
(2)SAM含量的测定。采用高效液相色谱法[13]。取1 mL发酵液，12 000 r/min高速离心2 min，弃上清液，加入200 μL超纯水，200 μL乙酸乙酯，30 ℃金属浴振荡30 min，随后加入500 μL 0.35 mol/L硫酸，振荡1.5 h后12 000 r/min离心2 min，取上清液，0.22 μm有机膜过滤待测。
液相测定条件：色谱柱J&K C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，流动相为40 mmol/L 磷酸二氢铵，2 mmol/L庚烷磺酸钠和18%(体积分数)甲醇水溶液，检测波长254 nm，流速1.0 mL/min,进样量10 μL，柱温30 ℃。
(3)葡萄糖含量测定。3,5-二硝基水杨酸法[4]。
2 结果与分析
2.1 高产菌株筛选
2.1.1 菌株ZY生长曲线与最佳照射剂量的确定
对酿酒酵母进行ARTP诱变时，一般使用对数生长中后期的菌体进行诱变，由于此时菌株酶活力高，生长旺盛且易发生突变[15]。每隔2 h取样测600 nm吸光值(OD600)绘制菌株ZY生长曲线。由图1可知，菌株对数期生长期在4～12 h，确定培养6～8 h的酵母细胞进行ARTP诱变与137Cs γ-射线诱变。经过照射时间和剂量的优化，发现ARTP照射180 s致死率在87.4%，由于诱变的致死率在80%～90%之间时，突变率相对较高，获得优良性能菌株的可能性最大[16]，故实验选择ARTP诱变照射时间为180 s。取ARTP照射后的优势菌株，进行γ-射线辐照，照射剂量700 GY时致死率在87%，故实验选择γ-射线诱变照射剂量为700 GY。
图1 ZY菌株摇瓶生长曲线
Fig.1 Growth cur e of strain ZY in shake flask fermentation
2.1.2 ARTP诱变育种结果
ARTP照射菌株ZY 180 s，培养后涂布于乙硫氨酸筛选平板，挑选相对较大的单菌落进行摇瓶发酵培养。经过5轮诱变，共获得比出发菌株SAM产量高20% 的突变株23株。通过摇瓶复筛，突变株A-17的SAM产量最高，较出发菌株ZY提高了55.5%(表1)。因此，选择突变株A-17为进一步诱变的出发菌株。
表1 ARTP诱变复筛结果
Table 1 The rescreening results of ARTP mutagenesis
2.1.3 137Cs γ-射线诱变育种结果
突变株A-17经700 GY γ-射线照射4轮，共获得比出发菌株SAM产量高20% 的突变株11株。通过摇瓶复筛，突变株AC-4、AC-6和AC-10的SAM产量提升较高，其中突变株AC-10的SAM产量达到1.15 g/L，比突变株A-17提高了36.9%，比菌株ZY提高了130.0%(表2)。
表2 137Cs γ-射线诱变复筛结果
Table 2 The rescreening results of 137Cs γ-mutagenesis
2.1.4 突变株遗传稳定性
为考察突变株传代后发酵水平稳定性，采用平板划线方法传代培养，将复筛的突变株AC-4、AC-6和AC-10各传代10次。挑取偶数代检测SAM含量，结果见图2。与突变株AC-4和AC-6相比，突变株AC-10的SAM产量较高且能稳定遗传，因此选作SAM的生产菌株。
图2 突变株AC-4、AC-6和AC-10遗传稳定性
Fig.2 The inherit stability of mutant AC-4,AC-6 and AC-10
2.1.5 突变株AC-10摇瓶培养条件优化
2.1.5.1 培养温度的确定
考查了24、27、30、33和36 ℃对突变株AC-10生长和SAM产量的影响。由图3可知，温度对菌体量无显著影响，而对SAM产量有显著影响。30 ℃时菌体量和SAM产量都达到最大，分别为7.19 g/L和1.16 g/L，当温度继续升高，SAM产量则降低。综合SAM产量和菌体量，选择30 ℃为最适培养温度。
图3 温度对突变株AC-10生长和SAM生产的影响
Fig.3 Effect of temperature on growth and SAM titer
of mutant AC-10
2.1.5.2 初始pH的确定
pH会对菌体细胞结构、参与代谢的各种酶活性力产生较大影响，间接影响菌体对培养基的利用，菌体的生长以及产物的生成[17]。在30 ℃下研究了不同初始pH值对突变株AC-10生长和SAM产量的影响。由图4可知，初始pH由4.5提高到7.5的过程中，SAM产量和生物量变化显著，且偏酸性环境有利于菌体生长和SAM生成，初始pH为5.5时菌体量及SAM产量达到最大值，分别为7.24 g/L和1.21 g/L。因此，选择初始pH 5.5为最适pH。
图4 初始pH对突变株AC-10生长和SAM生产的影响
Fig.4 Effect of initial pH on growth and SAM titer of mutant AC-10
2.1.6 突变株AC-10 5 L发酵罐分批补料发酵
在5 L发酵罐中温度控制30 ℃，用氨水调节pH至5.5，以分批补料方式考查突变株AC-10产SAM的能力，其发酵曲线见图5。整个发酵过程可分为适应期、快速生长期和转化期3个阶段。发酵前期，菌株生长缓慢，糖耗低，培养至15 h葡萄糖基本耗完，溶氧迅速升高，此时开始流加培养基，起始流加速度10 mL/h，其中葡萄糖流加浓度约为2.5 g/(L·h)。15 h后菌株生长迅速，糖耗高，通过调节流加速度，使罐内残糖控制在5 g/L左右。配合转速与通气量调节，使溶氧保持在10%～20%。参考王杰鹏等[18]]蛋氨酸补加策略，当菌体量达到100 g/L时开始补加蛋氨酸。52 h时加入8 g L-蛋氨酸作为前体，此后每隔4 h补加一次。在L-蛋氨酸加入之前，胞内几乎没有SAM积累，在加入后则快速生成，在第68 h SAM产量达到5.62 g/L，最高产率为0.63 g/(L·h)。
图5 AC-10突变株5 L发酵罐分批补料发酵曲线
Fig.5 Time course of fed-batch fermentation by mutant AC-10
突变株AC-10在菌体量和SAM产量方面比原始菌株均有所提高，摇瓶中SAM最高产量为1.21 g/L，经5 L发酵罐分批补料发酵，SAM产量可达5.62 g/L，与HUANG等[9]、CAO等[10]报道的SAM产量基本持平。突变株AC-10在52～62 h最高SAM产率为0.63 g/(L·h)，但62 h后生长明显停滞，原因可能是营养物质匮乏间接导致SAM产量降低。参考酿酒酵母发酵SAM的报道，如LI等[19]以突变株酿酿酒酵母CGMCC 13760利用豆腐黄浆液发酵SAM，在优化的工艺条件下，产量达到16.14 g/L;王杰鹏等[20]通过酿酒酵母SAM0801高密度发酵SAM，在优化的工艺条件下，SAM产量达到17.1 g/L;而LIU等[21]使用CRISPR工具整合外源基因获得重组酿酒酵母HDL-R2菌株，通过蛋氨酸补加策略优化，SAM产量达到10.3 g/L。因此，突变株AC-10仍有进一步发掘的潜力，后续可通过发酵工艺优化达到高密度发酵、蛋氨酸添加策略优化或遗传改造，进一步提高其SAM产量。
3 结论
针对S. cere isiae ZY发酵生产SAM产量低的问题，对其进行了5轮ARTP诱变和4轮137Csγ-射线辐照诱变，结合乙硫氨酸、制霉菌素抗性平板筛选，获得1株遗传稳定性较好的突变株AC-10，其SAM产量为1.15 g/L，与出发菌株ZY相比提高了130.0%。通过摇瓶培养条件优化，确定最适条件为30 ℃、初始pH 5.5，经5 L发酵罐分批补料发酵68 h后SAM产量达到5.62 g/L。结果表明,ARTP与137Csγ-射线突变率高，易获得遗传稳定性良好突变株，结合乙硫氨酸、制霉菌素抗性的理性化筛选育种，能够提高筛选效率。本研究可为发酵法生产SAM奠定基础。
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