目前，关于酯酶的研究大多集中于在微生物来源，相比之下，动物源的酯酶，特别是海洋动物来源的酯酶的相关分离纯化与性质研究尤为少见。蓝圆鲹（Decapterus maruadsi）是我国重要的低值海洋经济鱼类之一，其价格低廉、味道鲜美、营养丰富，深受消费者的喜爱。集美大学海洋食品与生物工程学院的孙乐常、文嘉欣、曹敏杰*等拟以蓝圆鲹为对象，从其肝脏中分离纯化天然酯酶，并对其性质进行分析，旨在为海水鱼内脏中酯酶的应用提供理论参考。
01
蓝圆鲹肝脏酯酶的分离纯化与鉴定
如图1A所示，在0～1.0 mol/L NaCl线性洗脱过程中，出现2 个较高的酯酶活性峰，收集酶活性较高而蛋白含量较低的第2个酶活性峰组分（133～143管）。将活性峰用缓冲液A透析后上样于Q-HP阴离子交换层析预装柱，如图1B所示，目的蛋白在NaCl浓度约0.5 mol/L下被洗脱（31～37管）。将其收集后用缓冲液B透析后上样于Phenyl Fast Flow疏水层析预装柱。
如图1C所示，大量的杂蛋白在(NH4)2SO4浓度约为0.8 mol/L之前被洗脱下来，而目的蛋白在(NH4)2SO4浓度约0.5 mol/L被洗脱下来。收集的活性组分最终通过Superdex G75凝胶过滤层析柱得到纯化（图1D）。
由表1可知，经40%～60% (NH4)2SO4分级沉淀、Q-Sepharose、Q-HP、Phenyl Fast Flow和Superdex G75后获得了高纯度的酯酶，最终的纯化倍数为1 150，回收率为0.69%。
通过银染结果（图2A）可知，纯化的蛋白在还原与非还原条件均显示分子质量为61.18 kDa的单一条带，说明该酶不存在二聚体。该结果与Superdex G75凝胶过滤层析后对照标准蛋白所测算的分子质量一致（图2B），也与其他来源酯酶的分子质量相近。对纯化得到的蛋白进行蛋白质串联质谱的肽指纹图谱鉴定，得到一条含14 个氨基酸残基的肽段（LAAPQPVEGWEGVR），检测m/z为1 508.858 3。在NCBInr数据库中进行序列比对，发现其与红鳍东方鲀假定脂酰辅酶A水解酶（序列号：XP_003967349.2 ）一致，进一步表明纯化的酶为一种新型酯酶。实验中酯酶鉴定匹配的多肽数量较少可能是由于目前数据库中缺乏足够的鱼类内脏酯酶的蛋白一级序列数据。
02
蓝圆鲹酯酶的性质
温度和pH值对酯酶活性的影响
如图3A所示，蓝圆鲹肝脏酯酶的最适温度为50 ℃，在30～60 ℃有较强的活性，当温度上升至70 ℃，酯酶活性明显降低。该酶在4～40 ℃之间有较高的稳定性，随着温度升高，酶稳定性降低，当温度上升到60 ℃后，只保留约30%的酶活性。
如图3B所示，蓝圆鲹肝脏酯酶的最适pH值为8.0，在7.0～8.0有较强的活性，当pH值超过9.0时，酶活性快速下降，并在pH 10.0时完全失活。该酶在pH值在6.0～10.0之间具有较高的稳定性，在酸性环境下不稳定，在pH 4.0时，该酶活性完全丧失。相比之下，在碱性条件下较稳定，当pH值达到11.0时，依然能保留50%以上的活力。
金属离子和Na＋对酯酶活性的影响
如图4A所示，金属离子Al3＋、K＋、Zn2＋、Fe2＋和Cu2＋会使酯酶活性显著下降，其中Fe2＋和Cu2＋对该酶有强烈抑制作用。Mn2＋、Ba2＋、Ca2＋、Co2＋和Mg2＋则会促进酶的活性，其中Mn2＋对酶的激活作用最强，而Mg2＋和Co2＋对酶活性的影响较小。二价金属离子对酯酶活性影响的内在机制复杂，其抑制作用可能是由于部分二价金属离子会优先结合到酶的活性中心，进而影响酶与底物的结合与催化。
为评估酯酶在食品加工中的潜在应用前景，探究了不同浓度Na＋对酯酶活性的影响。如图4B所示，在0～2 mol/L范围内，不同浓度Na＋对酯酶活性都具有促进作用，在0.02～0.5 mol/L范围内，Na＋对酯酶活性具有较强的促进作用，在浓度为0.2 mol/L时促进作用最显著，为空白对照的1.9 倍。这可能是因为Na＋改变了溶液的极性，促进了底物与酶活性中心的相互作用，从而使酶活性升高，而高浓度Na＋会使酶发生盐析作用，使酶活性降低。
表面活性剂和有机溶剂对酯酶活性的影响
如图5A所示，当用量为1%时，4 种有机溶剂对酯酶活性几乎没有影响，而用量为10%时，4 种有机溶剂对酯酶活性都起到了不同程度的促进作用，其中，丙酮的促进作用较小。
进一步探究不同浓度SDS对酯酶活性的影响，结果如图5B所示，当SDS质量分数为0.1%时就使酯酶完全失活，这可能是SDS能够使酯酶中的氢键和疏水键被破坏从而使其空间构象发生改变从而使酯酶失活。
酯酶的底物特异性
如表2所示，蓝圆鲹肝脏酯酶在水溶液中对短链脂肪酸的特异性较高，随着底物碳链的增长，其水解能力有所下降。该酶在水溶液中对p-NPA（C2）的水解活性最高，其次是p-NPB（C4），其相对酶活性接近90%，而该酶在水溶液中对p-NPD（C10）和p-NPP（C16）脂肪酸的水解作用微弱。而在乳化体系中，酯酶对p-NPD（C10）和p-NPP（C16）也有较高的水解能力，相对酶活性达到70%以上。以上结果说明，纯化的酶为一种新型酯酶，在界面活化后同时拥有酯酶和脂肪酶的功能，具有较大的应用价值。
结 论
通过色谱分离从蓝圆鲹肝脏中分离纯化出一种新型酯酶，分子质量约为60 kDa，最适温度和最适pH值分别为50 ℃和8.0，高温和酸性条件下不稳定，对有机试剂和盐的耐受性高。Zn2＋、Cu2＋和Fe2＋会使酯酶活性显著下降，而Ba2＋、Ca2＋和Mn2＋能显著提高酶活性。该酶在乳化体系中，对短链和长链酯都具有较强的水解能力，同时具备酯酶与脂肪酶活性。
本文《蓝圆鲹肝脏酯酶的分离纯化与性质分析》来源于《食品科学》2022年43卷6期158-164页，作者：孙乐常，文嘉欣，杜瀚，林怡晨，刘光明，曹敏杰。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210201-014。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
