喜树碱是从喜树皮和果实中提取的抗肿瘤植物药，对胃肠道肿瘤和头颈癌等有良好的疗效，但会引发中性粒细胞减少和迟发型腹泻等不良反应。7- 乙基-10 羟基喜树碱(SN-38，1) 属于喜树碱类药物，是已上市药物伊立替康(CPT-11，2) 的活性代谢产物，其抗肿瘤活性是2 的100 ～ 1 000倍，具有作用强、活性高的特点。1 的作用机制是通过稳定拓扑异构酶(Topo) Ⅰ与DNA 形成的复合物而促进细胞凋亡，继而干扰DNA 的复制。
1 虽然具有较强的抗肿瘤活性，但极难溶于水和大部分生物相容性溶剂，与酸不能成盐。此外，1 的内酯环是其抗肿瘤活性的关键部位，但该结构不稳定，对热、光、碱等敏感，在pH 7 或以上时大部分的内酯结构开环变成羧酸盐，抗肿瘤活性显著降低，不良反应增加，极大限制了1 的应用。
脂质体是由磷脂与胆固醇组成的具有双层结构的封闭囊泡，生物相容性优良，作为载体有较大的优势，并具有被动靶向、长效、缓释等优点。本研究采用薄膜水化- 高压均质法制备1 长循环脂质体，拟为开发高效、低毒、长循环的1 新制剂提供帮助。
1 仪器与试剂
Alliance 2695 型高效液相色谱仪；
Nano-ZS90 型粒度测定仪；
ZLXS5003Y 型纯水仪；
Tecnai G2 F20 型透射电镜。
1 原料药；2 注射液；盐酸伊立替康三水合物；5 ％ 葡萄糖溶液；氢化大豆磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺- 聚乙二醇2000；胆固醇；葡聚糖凝胶Sephadex G-50；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 处方及工艺
采用薄膜水化- 高压均质法制备1 脂质体悬液。称取1 原料药20 mg、HSPC 600 mg、胆固醇200 mg 和DSPE-PEG2000 120 mg，置圆底烧瓶中，加入氯仿∶甲醇(8 ∶ 1)40 ml，超声溶解，于60 ℃减压旋蒸除去有机溶剂成膜。加入2 mmol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0)40 ml，水化形成脂质体初乳，再经微射流高压均质机以137.9 MPa 的压力均质5次，即得澄清透明的1 脂质体悬液。再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4 ℃密封保存。
2.2 脂质体的形态及粒度分布
2.2.1 脂质体的形态
取“2.1”项下制备的1 脂质体悬液，以水适当稀释后用2％磷钨酸负染，滴至专用铜网上，自然挥干，静置使粒子在铜网上沉积，用透射电镜观察其形态。结果在透射电镜下观察到1 脂质体的外观呈球形或椭球形( 图1)。
图1 1 脂质体的透射电镜照片(×3 000)
2.2.2 1 脂质体的粒度分布及ζ 电位测定
取“2.1”项下制备的脂质体悬液，以超纯水稀释后，测定粒径及ζ 电位。结果( 图2) 显示，脂质体的平均粒径为(110±5)nm( n=3)，PDI 为0.25±0.05(n=3)，表明制备的脂质体粒度分布比较均一；ζ 电位为(-17.6±1)mV(n=3)。
2.3 1 脂质体包封率的测定
2.3.1 色谱条件
色谱柱 Waters XBridge C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ；流动相 乙腈∶水(30 ∶ 70) ；检测波长265 nm；柱温30 ℃；流速1.0 ml/min；进样量20 μl。
图2 1 脂质体的粒度分布(A) 及ζ 电位分布(B)
2.3.2 方法学考察
以甲醇配制1 的系列浓度溶液，分别进样测定。以峰面积(A) 为纵坐标、1 浓度( c) 为横坐标进行线性回归，得到的标准曲线方程为A=65 922.17c-1435.12( r=0.999 9)，结果表明1 浓度在0.25 ～10 μg/ml 范围内线性良好。
取同一供试品溶液，按上述色谱条件重复进样测定5 次，记录峰面积，计算得RSD 为0.60％( n=5)，表明精密度良好。取同一供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件在0、2、4、6、8 和12 h 进样测定，计算得RSD 为1.01％ (n=6)，表明供试品溶液在12 h 内稳定。高、中、低浓度样品的平均加样回收率分别为(102.45±0.33)％、(100.00±0.28)％、(99.78±1.93)％ (n=3)。
2.3.3 洗脱曲线的绘制
取充分溶胀( 冷水中浸泡12 h 以上) 的葡聚糖凝胶Sephadex G-50，装填于色谱柱内，制备凝胶柱(45 cm×1 cm)，共制备2 根。取1 溶液( 取1 原料药5 mg，加入10 mmol/L 氢氧化钠溶液10 ml 溶解即得) 及“2.1”项下制备的1 脂质体悬液0.5 ml上柱，分别以10 mmol/L 氢氧化钠溶液及25 mmol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0) 洗脱。按每管2 ml 收集洗脱液；碱洗脱液加入盐酸酸化后进样测定，带有乳光的酸洗脱液用甲醇溶解后进样测定。结果显示1脂质体在第7 ～ 14 管流出，游离药物在第20 ～ 44管流出，表明游离药物与脂质体可实现良好的分离( 图3)。
图3 洗脱曲线
2.3.4 柱回收率与柱加样回收率
配制3 种不同浓度的1 溶液，分别取0.5 ml 上柱，将收集的药物组分酸化后，按“2.3.1”项下条件进行色谱分析，计算柱回收率。结果平均值为(96.23±2.33)％ (n=3)。另将3 种不同浓度的1溶液与空白脂质体混合，得标准混合液，分别取0.5 ml 上柱， 将收集的药物组分酸化后进样测定， 计算得柱加样回收率， 结果平均值为(101.53±2.63)％ (n=3)。
2.3.5 包封率测定
精密量取“2.1”项下1 脂质体悬液0.5 ml 上柱，先以25 mmol/L 乙酸钠缓冲液(pH 5.0) 洗脱至脂质体组分全部流出，再换用10 mmol/L 氢氧化钠溶液洗脱未包封的游离药物。按洗脱曲线收集脂质体组分，移至50 ml 量瓶中，用甲醇定容，摇匀后精密量取5 ml 置10 ml 量瓶，再用甲醇定容，用于测定脂质体中包载的药量W。另取脂质体悬液0.5 ml 置50 ml 量瓶中，同法操作，测得脂质体悬液中的总药量W0。按“2.3.1”项下色谱条件分别进样测定，计算得1 脂质体的包封率为(93±3)％ (n=3)。
2.4 脂质体体外释放测定精密量
取“2.1” 项下1 脂质体悬液和1 溶液1 ml，分别置经预处理的透析袋( 截留分子量10 000) 中，将袋口扎紧，置释放介质[1％十二烷基硫酸钠(SDS) 的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)]20 ml 中，于(37±5)℃恒温振荡，转速为100 r/min。分别于2、4、6、12、24、30、36、48、60、72、78 和84 h 取出全部释放介质( 及时更换同温等量释放介质)。取不同时间点的释放外液1.5 ml，加入10 mol/L 盐酸20 μl 酸化后按“2.3.1”项下条件测定，计算累积释放率(Q)。结果表明，1 溶液在36 h 时的释药量可达90.2％，而1 脂质体在84 h 时的累积释放率为55.6％，表明1 脂质体具有一定的长循环和缓释效果( 图4)。
图4 1 脂质体的体外释放曲线(n=3)
2.5 药效学试验
2.5.1 动物模型的建立
将人胰腺癌AsPC-1 细胞株以每只5×106 个的密度接种至裸鼠右侧腋窝皮下。用游标卡尺测量肿瘤直径，待肿瘤生长至体积约为300 mm3，取出肿瘤组织剪切成约1.5 mm3 的瘤块，在无菌条件下接种于健康裸鼠右侧腋窝皮下，待肿瘤生长至平均体积为140 ～ 150 mm3，分组给药。
2.5.2 试验用药
2 注射液：取盐酸伊立替康三水合物2.17 g( 相当于含2 2 g)、山梨醇4.5 g、乳酸90 mg，加入适量灭菌注射用水，超声溶解，用1 mol/L 氢氧化钠溶液调至pH 3.5，加灭菌注射用水至200 ml，经0.22 μm 滤膜无菌过滤，按每瓶10 ml 分装。临用前以5％葡萄糖溶液稀释到给药浓度。
1 脂质体注射液：取“2.1”项下制备的脂质体悬液，临用前以5％葡萄糖溶液稀释至给药浓度。
2.5.3 试验分组与给药
将18 只荷瘤裸鼠随机分为3 组，分别为试验组(1脂质体，5 mg/kg)、阳性对照组(2 注射液，10 mg/kg)、对照组(5％葡萄糖溶液)。以上3 组试验动物均每周尾静脉注射给药3 次( 间隔1 d)，连续给药3 周，给药体积均为0.2 ml。
2.5.4 药效评价指标
试验中观察裸鼠的一般生理情况及移植瘤体积增长情况。每周2 次称量裸鼠体质量并记录，同时测量移植瘤长径(a) 和短径(b)，按公式计算肿瘤体积V(V=0.5×a×b2)。最后一次给药24 h 后处死动物，剥离肿瘤并称重。以相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)、体积抑瘤率(voluminhibition rate，VIR)、瘤重抑制率(weigh inhibitionrate，WIR) 为指标进行药效学评价。计算公式如下。RTV=Vt / V0VIR=RTV对照/ RTV给药×100％WIR= (W对照-W给药)/W给药×100％式中，V0 为分组给药时测量所得的肿瘤体积，Vt 为每次测量时的肿瘤体积；W 为瘤重。
2.5.5 结果与讨论
给药时的裸鼠已处于成熟期，此阶段的健康裸鼠体质量会维持在20 g 左右。若给予荷瘤裸鼠的药物毒性大，会使裸鼠的体质量下降；若裸鼠的体质量无明显下降，则提示给予的药物无明显毒性。本试验中，给药组裸鼠的体质量无明显变化，表明1脂质体对裸鼠生长无明显的毒性( 图5)。
图5 荷瘤裸鼠的体质量(n=6)
1 脂质体组对人胰腺癌AsPC-1 裸鼠皮下移植瘤的生长抑制作用与2 注射液相当( 图6)，提示1脂质体(5 mg/kg) 与2 注射液(10 mg/kg) 效用相当。
图6 各试验组的相对肿瘤体积(A)、体积抑瘤率(B) 和瘤重抑制率(C)(n=6)
讨论
1 是伊立替康的活性代谢产物，水溶性和脂溶性均较差，本试验采用薄膜水化- 高压均质法制备脂质体，操作简便快速，制得的脂质体粒径均一、包封率高，具备开发前景。DSPE-PEG2000 的加入可以降低网状内皮细胞对于脂质体的摄取，延长药物体内循环的时间；并可使脂质体荷负电，增加脂质体的物理稳定性。由于目前无1 的上市制剂，所以药效学试验中采用2 注射液为阳性对照。理论上，1 应分布在脂质体的双分子层中，可减少其内酯环的开环，有利于提高药效。因此在设计给药剂量时，1 脂质体为5 mg/kg，而2 注射液为10 mg/kg。本试验表明，试验组和阳性对照组对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制效果相似，提示1 脂质体的药效较高，具有一定的临床优势。
1 脂质的体外释放采用动态透析法测定。由于1 在PBS 中溶解度较小，为达漏槽条件，在PBS中加入1％ SDS。1 脂质体在84 h 累积释放率为55.6％，可能是因为HSPC 的相变温度为53 ℃，在37 ℃的释放条件下该脂质体较稳定，为药物在体内的长循环释放提供了可能。
采用制剂手段将1 制备成脂质体弥补了其自身的生物药剂学缺陷，避免了体内开环失活。相较于自制的2 注射液既提高了生物安全性又增强了疗效，因此1 脂质体剂型具有开发前景。[1]
