随着mRNA药物、疫苗以及基因治疗的发展，质粒DNA也在微生物领域平台得到广泛的应用，质粒DNA既可作为重组病毒载体生产中病毒外包装的原料，也可作为核酸药物单独使用，还可进行基因编辑预防单基因疾病的产生。它有三种拓扑结构，分别是超螺旋、开环和线性构型，这三种构型质粒的介绍与检测方法详见国庆特辑|mRNA小指南-质粒检测学问多，跟着入门不怕错[1]，其中超螺旋结构的质粒 DNA 转化和表达效率最高。因此超螺旋质粒纯化至关重要。今天，菌菌就给大家分享一篇文献《Purification of supercoiled p53-encoding plasmid using an arginine-modified macroporous support》[2]，希望此篇文章能给焦头烂额的科研大狗们在纯化填料的选择方面一些小提示！
图1 质粒DNA的不同构型
为了更好地学习文献，我们先来了解一下质粒 DNA 的生产过程，其主要包括菌体发酵、回收细胞（过滤或离心）、细胞裂解（碱裂解法）、去除细胞碎片和固体杂质，净化和浓缩（选择沉淀）及色谱纯化。
图2 质粒DNA 疫苗的构建、生产和纯化流程
P53是一种肿瘤抑制基因，已被用于癌症基因治疗，作为一种可能的替代普通治疗方法。使用质粒DNA (pDNA)携带治疗基因已经被考虑过，但必须保留其超螺旋（sc）结构，以诱导更有效的基因表达和治疗作用。
用氨基酸亲和层析法纯化sc DNA已经成功应用，大量文献表明精氨酸对sc pDNA的识别具有明显的选择性。然而，在精氨酸-琼脂糖载体中发现了一些结合能力的限制[3-5]，利用精氨酸修饰的大孔载体，可以充分利用配体的选择性、载体的流动特性和结合能力。
本次分享的文献通过扫描电镜（SEM）、能谱分析(EDX)和傅里叶红外光谱(FTIR)对精氨酸修饰的大孔载体进行了表征，验证了精氨酸固定化的正确性，并用于pDNA纯化。该载体对sc p53-pDNA的分离是有效的，而且只需稍微调整实验条件，就可以完成不同大小质粒的纯化。在精氨酸修饰的大孔载体的动态结合能力方面，与它们的同源精氨酸-琼脂糖商业基质相比，其pDNA结合能力提高了50%以上。文献的主要研究内容分为三方面：
（1）精氨酸配基改性大孔基质的表征，精氨酸亲和配基的偶联主要利用精氨酸的 α-氨基与活化介质表面的环氧基在碱性条件下发生开环反应，从而将精氨酸共价偶联到活化的介质 S-Sep CL-6B 或 L-Sep CL-6B表面。
（2）分离纯化sc p53编码质粒。
（3）对精氨酸改性大孔基质的通用性进行了测试，并纯化不同质粒。
图3 精氨酸改性大孔基质的表征:A-固定化前大孔基质的化学结构;B-精氨酸配基;C精氨酸配基与大孔基质的偶联
用NZYTech试剂盒预纯化p53编码的pDNA (sc和oc亚型)。简单地说，碱性裂解后，pDNA分子在适当的低盐和pH条件下与NZYTech阴离子交换基质结合。然后通过中盐洗涤去除杂质，最后通过增加离子强度洗脱pDNA。
图4 技术路线
精氨酸改性大孔载体的表征-SEM
精氨酸在大孔载体中固定后，对基体进行表征，以验证与初始珠粒相比，载体的形态是否会发生变化。扫描电镜(SEM)结果表明，在固定过程中，珠子的完整性没有差异，这表明所使用的支架固有的物理性能保持不变。
图5大孔基质的SEM图像
未改性大孔基质的SEM图像:A- 300X, B- 1000X, C- 5000 X
精氨酸改性大孔基质:D- 300x, E- 1000X, F- 5000 X
精氨酸改性大孔载体的表征-FTIR
傅里叶变换红外光谱结果表明，与空白对比， C-N键对应的吸收峰保证了固定化过程的成功；1671 cm附近的N-H变形表明胍基的存在；此外，可以观察到仲胺向较低的波数(1574 cm-1)处转移。综上，可以确定精氨酸成功结合到原始载体上[6-7]。
图6 精氨酸固定化配基的FTIR光谱，( A )伯胺的N-H ( B )仲胺的N–H
精氨酸改性大孔载体的表征-EDX
改性基质中存在N原子，证明精氨酸配基固定在大孔基质上。N原子占元素总数的11.9%，对应的配基密度为1.44 mg/mg。
图7 精氨酸改性配基的EDX分析
精氨酸改性大孔载体纯化p53编码质粒（sc+oc）
采用硫酸铵和NaCl梯度评估了不同的结合/洗脱策略。进行初步研究后通过调整梯度条件，对sc pDNA的分离进行评估，考虑盐浓度和pH值。最佳结合条件是用10 mM Tris-HCI和10 mM EDTA进行精氨酸修饰的大孔基质平衡（pH为8.0，温度为4℃）。在此条件下，注入100 uL的p53编码pDNA (sc和oc亚型)，然后，用相同的缓冲液(10 mM Tris-HCI和10 mM EDTA, pH 8.0)将离子强度逐步增加到310 mM NaCl，最后增加到IM NaCl，依次洗脱结合产物。
图8 精氨酸大孔基质中纯化pDNA异构体分离的色谱图和琼脂糖凝胶电泳
电泳凝胶中L泳道代表预纯化的pDNA样品，1、2、3泳道分别对应色谱图的峰。
在进行色谱实验时，当改变缓冲液的温度或pH值时，也会对实验结果产生影响。在保持其他实验条件不变的情况下，将温度提高到20°C会导致pDNA结合显著增加；当pH为6时也促进了pDNA结合的增加，这些结果与之前在固定精氨酸得到的结果一致，但要保证pDNA的回收率和纯度，必须考虑所有参数的平衡。
在这种特殊情况下，随着温度的升高，DNA结合的增加是疏水相互作用引发的典型行为，说明这些条件一般会影响pDNA的盘绕程度，也可以促进其他类型的相互作用(即疏水相互作用)，有助于pDNA的结合。
图9 精氨酸大孔基质中纯化pDNA异构体分离的色谱图和琼脂糖凝胶电泳
洗脱采用逐级梯度，第一步用10mm的Tris-HC1和10mm的EDTA，第二步用310 mM的NaCl，最后一步用1m的NaCl在相同的缓冲液中(10mm的Tris-HC1和10mm的EDTA)。电泳凝胶中，L泳道代表预纯化的pDNA样品，1、2、3泳道分别代表色谱图的峰。(A) 20C；(B) pH=6
精氨酸改性大孔载体的动态吸附容量（Dynamic binding capacity，DBC）
与以琼脂糖为基础的商业基质相比，改性后的大孔基质提高了DBC的值。如果想要扩大pDNA纯化工艺的规模，这种产能的增加将是非常有价值的，因为它可以减少生产运行和成本，增加每次实验的pDNA回收率和下游工艺的可行性。
商业精氨酸琼脂糖载体DBC较低可能与颗粒表面可用配体数量有限有关，限制了对pDNA等大分子的结合能力[8]。
关于实验条件对DBC的影响，科研工作者在研究中发现最低温度时DBC略高，这可能与DNA的三维空间有关，因为温度降低会促进DNA的致密化。在结合过程中，预期一个更紧密的分子会占据更少的配体或结合位点，从而留下更多的接触点供其他分子结合。至于pH的影响，在研究的pH范围内，无法验证DBC的显著差异。
表1 比较了精氨酸改性大孔基质在不同流速、温度和pH条件下p53编码pDNA的动态吸附容量
图10 精氨酸改性大孔基质的突破性实验
流速:1 mL/min、0.5 mL/min;原料:p53编码pDNA溶液(0.05 mg/mL)，在pH 为8和4℃的10 mM Tris-HCl缓冲液中
精氨酸改性大孔载体对不同质粒纯化的适用性
精氨酸改性大孔载体对不同质粒纯化的适用性实验结果表明: 通过这种新的精氨酸修饰的大孔基质，只需要调整实验条件，就可以分离sc p1321 HPV16 E6/E7 pDNA和pUC19 pDNA。因此，证明了这种新基质能够促进从不同分子量的质粒中分离sc亚型，而且不会影响所需的分辨率，也不会出现堵塞问题。
图11 不同大小的pDNA在精氨酸大孔基质中纯化的sc pDNA的色谱图
(A) p1321 HPV-16 E6/E7 pDNA（8.7kpb） (B) pUC19 pDNA（2.9kpb）
选择性分离p53 sc pDNA
使用精氨酸改性大孔载体通常使得sc pDNA回收率为43%，纯度为92%。
图12 sc p53-pDNA的色谱图谱
1. 文献通过SEM、EDX和FTIR对精氨酸修饰的大孔载体进行了表征，验证了精氨酸固定化的正确性。
2. 将精氨酸改性的大孔载体用于pDNA的纯化，纯化过程受温度和pH的影响，该载体对sc p53-pDNA的分离是有效的，只需稍微调整实验条件，就可以完成不同大小质粒的纯化。
3. 对新载体的DBC进行表征，结果表明，与商业精氨酸配基相比，DBC提高了50%以上。这一结果可以被认为是该基质用于工业目的的一个主要优势，因为高吸附容量因此可以增加pDNA的收率，这也将增加下游工艺的可行性。
综上所诉，菌菌分享的此篇文献为sc pDNA纯化领域开发了一种新的、有前景的色谱支持，可作为一种强大的、有用的工具用于纯化治疗性质粒。
参考文献：
[1] https://mp.weixin.qq.com/s/74GVRa44raQLKMH8rcKlow.
[2] Valente J , Sousa N , Azevedo G A , et al. Purification of supercoiled p53-encoding plasmid using an arginine-modified macroporous support[J]. Journal of Chromatography A, 2020:460890.
[3] J. Valente, A. Sousa, J. Queiroz, F. Sousa, Selective purification of supercoiled p53-encoding pDNA with l-methionine–agarose matrix, Analytical biochemistry 459 (2014) 61-69.
[4] A. Sousa, F. Sousa, J. Queiroz, Impact of lysine-affinity chromatography on supercoiled plasmid DNA purification, Journal of Chromatography B 879(30) (2011) 3507-3515.
[5] J. Valente, A. Sousa, J. Queiroz, F. Sousa, DoE to improve supercoiled p53-pDNA purification by O-phospho-l-tyrosine chromatography, Journal of Chromatography B 1105 (2019) 184-192.
[6] J.A.V. Butler, D. Noble, Progress in biophysics and molecular biology, Elsevier2014.
[7] M.G. González, J.C. Cabanelas, J. baselga, Applications of FTIR on epoxy resins-identification, monitoring the curing process, phase separation and water uptake, Infrared Spectroscopy-Materials Science, Engineering and Technology 2 (2012) 261-284.
[8] D.M.F. Prazeres, T. Schluep, C. Cooney, Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion-exchange chromatography, Journal of Chromatography A 806(1) (1998) 31-45.
