构建载体，你知道有哪些方法吗？
常见的有传统的酶切连接法、同源重组法和gibson法等。
今天我们来聊聊传统的酶切连接方法，小伙伴们也可以期待接下来要分享的载体构建方法。
原理
传统的酶切连接方法是用相同的限制性内切酶消化质粒和含有目的片段的DNA，得到具有相同的粘性末端或平末端的线性DNA（如图1），对酶切产物进行纯化后，再利用 DNA 连接酶将片段连入载体，得到重组质粒，将重组质粒转入感受态细胞中，进行后续的筛选、扩增。具体实验操作步骤请参考阅读《载体构建入门攻略——克隆载体篇》，此处不再赘述。
图1.酶切示意图
限制性内切酶是一种能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定位置切割DNA链中的磷酸二酯键的一类酶。限制性内切酶分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3种类型，Ⅰ型限制性内切酶是既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 在重组载体构建实验中常用的是Ⅱ型限制性内切酶在重组载体构建实验中常用的是Ⅱ限制性内切酶，不同的限制性内切酶会识别不同的DNA序列，它可以在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，酶切之后会形成不同类型的产物，如下图中的BamHI形成5’粘性末端产物，KpnI形成3’粘性末端产物，EcoRV形成平末端产物。
酶切连接方法有其适用的应用场景，但也存在耗时长、成功率较低、连接单个片段的限制，相对于来说，同源重组法和gibson法的适用范围更广，欲知详情，请听下回讲解。
注意事项:
在酶切酶连实验中经常有同学们会出现切不开，连不上的困惑，小贴士来啦！
1. 在连接带有粘性末端的 DNA 片段时，DNA 浓度一般为 2-10 mg/mL，在连接平齐末端时，需加入 DNA 浓度至 100-200 mg/mL；
2. 酶切产物与载体的比例需要掌握好，一般情况下，酶切产物：载体摩尔比=3：1~9：1；
3. 一定要做对照试验，阴性对照不加入目标片段的线性骨架自连对照，目的在于排除载体自连；
4. 阳性对照使用感受态细胞生产商提供的标准质粒进行转化，目的是在转化失败时，用来验证转化失败的原因是否为感受态细胞效率低甚至失活，或转化过程失误；
5. 双酶切时一定不要选择产生同样黏性末端的不同酶，同尾酶会造成片段插入载体的方向不固定，插入方向错误会导致无法正常表达翻译；
6. 限制性内切酶的用量需要根据说明书的活性效率去计算是相对准确的；
7. 酶切体系尽量选择较大体系，如50 uL、100 uL等。限制性内切酶保存在甘油中，甘油会影响很多限制性内切核酸酶的特异性，这是导致一些酶产生星号活性的主要原因之一,因此酶切反应体系中甘油的浓度尽量小于5%。大体系能稀释甘油浓度，对反应有利。相反，连接尽量用小体系10 uL或20 uL，以增加DNA末端的碰撞机会。
8. 影响限制酶活性的因素有以下几个方面：DNA的纯度、DNA的甲基化程度、DNA的分子结构、缓冲环境（缓冲液的pH及离子强度）和反应温度。在实验时要考虑这些因素，以提高反应的成功率。
