2, 5-二甲基吡嗪(2, 5-dimethylpyrazine，2, 5-DMP)，呈强烈的炒花生香气和巧克力、奶油气味，是一种重要的香味化合物和药物中间体，广泛存在于咖啡、花生等50多种天然食品中[1]。作为食品香料时，只添加1–2 mg/L的2, 5-DMP就可起到明显的增香作用，是国标GB2760-86规定为允许使用的香精[2]。此外，2, 5-DMP还是合成第二代磺脲类降血糖药格列吡嗪、新一代长效降血脂药阿昔莫司(Acipimox)以及治疗结核病的有效药物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯(Pyrazinoic acid esters，PAE)等一系列药物的原料或药物中间体[3]。因此，摸索2, 5-DMP经济高效的生产方法无疑是非常重要的。
2, 5-DMP的生产方法主要有提取法、化学合成法和微生物转化法，其中化学合成法是目前工业上普遍采用的生产方法[4]。需要指出的是，化学合成过程中所用的原料和催化剂以及形成的副产物具有一定的毒性，会对人和环境造成一定的危害[5]。微生物合成法相对于化学合成法有着反应条件温和环境友好等优点，却报道较少，仅仅止步于利用未经选育的野生型菌株，通过添加高浓度L-苏氨酸并优化培养条件进行生物转化。例如，Gros JB团队利用富含L-苏氨酸的大豆固体培养基培养枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis IFO 3013生产2, 5-DMP[4, 6]。近年来，研究者普遍认为L-苏氨酸是生物合成2, 5-DMP重要底物[3, 6-7]，合成途径如图 1所示。L-苏氨酸首先在苏氨酸脱氢酶的催化作用下生成2-氨基-3-酮丁酸，然后通过3步自发反应生成2, 5-DMP等产物。其中，L-苏氨酸脱氢酶(Threonine dehydrogenase，TDH，编码基因tdh)是整个生化反应的关键限速酶，因而筛选一种高活性的TDH对于2, 5-二甲基吡嗪的生物合成极为重要。TDH是一类NAD+依赖型且含Zn2+的二元醇/多元醇脱氢酶，是原核生物和真核生物中主要参与L-苏氨酸分解代谢的酶[8]。因此，每合成1 mol 2, 5-DMP，需消耗2 mol NAD+，同时产生2 mol NADH。然而，胞内NADH/NAD+水平在微生物生长和产物发酵过程中发挥多种生理功能，如调节胞内氧化还原水平、影响众多基因表达、细胞功能、代谢途径和物质跨膜运输等[9]。因此，胞内NADH/NAD+供应与消耗的不平衡，必将会影响2, 5-DMP的合成。
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| 图 1 以L-苏氨酸为底物合成2, 5-DMP的生物途径Fig. 1 The biosynthetic pathway of 2, 5-DMP from L-threonine. "×" represents inactivation and "SR" represents spontaneous reaction. |
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图选项
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在大肠杆菌中除了TDH参与L-苏氨酸分解代谢外，苏氨酸醛缩酶(Threonine aldolase，TA，编码基因tdcB)和苏氨酸脱氨酶(Threonine deaminase，TD，编码基因ilvA)也参与L-苏氨酸分解代谢，分别形成β-羟基-α-苏氨酸和α-酮基丁酸[10-11]。因此，在以L-苏氨酸为底物生物合成2, 5-DMP时，TA和TD的存在必将影响L-苏氨酸合成2, 5-DMP的转化效率。此外，除了2, 5-DMP合成的主代谢通路外还存在着其他代谢支路，即：(1) 2-氨基-3-酮丁酸CoA连接酶(2-amino- 3-ketobutyrate coenzyme A ligase，KBL，编码基因kbl)催化2-氨基-3-酮丁酸裂解形成甘氨酸[12]；(2)伯胺氧化酶(Primary amine oxidase，PrAO，编码基因tynA)催化α-氨基丙酮脱氨形成丙酮醛[13](图 1)。两条代谢支路的分流都会影响2, 5-DMP的合成，从而降低2, 5-DMP产率和产量。
本研究旨在基于代谢工程理论改造大肠杆菌碳代谢途径，降低副产物形成，提高L-苏氨酸转化2, 5-DMP的效率。在此基础上，结合辅因子工程策略，实现细胞内NAD(H/+)平衡再生，从而构建出以L-苏氨酸为底物高效清洁生产2, 5-DMP的重组大肠杆菌底盘细胞。
1 材料与方法1.1 试剂KH2PO4、K2HPO4·3H2O、NaOH和甘油购自国药集团试剂有限公司。胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxoid公司。2, 5-DMP标准品(纯度99.8%)和α-氨基丙酮标准品(纯度99.8%)购自美国ChromaDex公司。L-苏氨酸购自梅花生物科技集团股份有限公司。质粒提取试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker和Protein Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司。各种限制性内切酶、甲醇(色谱纯)和甲酸(色谱纯)购自美国ThermoFisher Scientific公司。大肠杆菌表达质粒pRSFDuet-1由江南大学康振教授惠赠。
1.2 菌株与质粒实验过程中涉及的菌株和质粒如表 1所示。另外，研究中使用的寡核苷酸列如表 2所示。
| Strains and plasmids | Characters | References |
| Strains | ||
| E. coli BL21(DE3) | F– ompT gal dcm lon hsdSB (rB mB) λ(DE3) | Stratagene |
| E. coli pRSFDuet-tdhX | E. coli BL21 harboring plasmid pRSFDuet-tdhX | This study |
| E. coli pRSFDuet-tdhEc-noxELc | E. coli BL21 harboring plasmid pRSFDuet-tdhEc-noxELc | This study |
| E. coli pRSFDuet-tdhEc-PnoxELc | E. coli BL21 harboring plasmid pRSFDuet-tdhEc-PnoxELc | This study |
| E. coli pRSFDuet-tdhEcnoxELc | E. coli BL21 harboring plasmid pRSFDuet-tdhEcnoxELc | This study |
| E. coli Δkbl ΔtynA | Deletion of genes kbl and tynA in strain BL21(DE3) chromosome | This study |
| E. coli Δkbl ΔtynA pRSFDuet-tdhEcnoxELc | E. coli Δkbl ΔtynA harboring plasmid pRSFDuet-tdhEcnoxELc | This study |
| E. coli Δkbl ΔtynA pRSFDuet-tdhEcnoxELc-PsstT | E. coli Δkbl ΔtynA harboring plasmid pRSFDuet-tdhEcnoxELc-PsstT | This study |
| E. coli Δkbl ΔtynA ΔltaEΔilvA | Deletion of genes ltaE and ilvA in strain E. coli Δkbl ΔtynA chromosome | This study |
| E. coli Δkbl ΔtynA ΔltaE ΔilvA pRSFDuet-tdhEcnoxELc-PsstT | E. coli Δkbl ΔtynA ΔltaE ΔilvA harboring plasmid pRSFDuet-tdhEcnoxELc-PsstT | This study |
| Plasmids | ||
| pRSFDuet-1 | Kanr, expression vector with two multiple clone sites (MCSs), T7 promoter and lac operator | Stratagene |
| pRSFDuet-tdhX | pRSFDuet-1 carrying gene tdh from different microorganisms | This study |
| pRSFDuet-tdhEc-noxELc | pRSFDuet-1 carrying gene tdh from E. coli and gene noxE from L. cremoris in the same MCS | This study |
| pRSFDuet-tdhEc-PnoxELc | pRSFDuet-1 carrying gene tdh from E. coli and gene noxE from L. cremoris in the different MCS | This study |
| pRSFDuet-tdhEcnoxELc | pRSFDuet-1 carrying the fusion gene tdhEc-noxELc | This study |
| pRSFDuet-tdhEcnoxELc-PsstT | pRSFDuet-1 carrying the fusion genes tdhEc-noxELc and sstT from E. coli | This study |
| Primers | Sequences (5′–3′) | Cleavage sites | Purposes |
| tdh-F | CGGGATCCGATGAAAGCGTTATCCAAACT | EcoRⅠ | Obtaining the gene of tdh from the genome of E. coli K-12 |
| tdh-R | GGAATTCTTAATCCCAGCTCAGAATAACT | KpnⅠ | |
| sstT-F | GGAATTCCATATGACTACGCAACGTTCACC | NdeⅠ | Obtaining the gene of sstT from the genome of E. coli K-12 |
| sstT-R | CCGCTCGAGTTAATTACGCAGGGCGC | XhoⅠ | |
| kbl-F | GCCCAGTTGTTTACCAAT | - | Verifying the existence of kbl |
| kbl-R | TGCGTGGAGAATTTTATC | - | |
| ∆kbl-F | CAGATGCCCTCTTCCGCTTTCAGTTTGGATAACGCTTTCATCTCACATCCCGTCTTGAGCGATTGTGTAG | - | Obtaining the knockout target fragment of kbl gene from pKD13 |
| ∆kbl-R | TATAAGTTTGGGTAATATGTGCTGGAATTTGCCCTGTCTGGAGAATCGCAGATAAGCTGTCAAACATGAG | - | |
| ∆kbl-YF | CGGAATAGGAACTTCAAG | - | Verifying the elimination of kanamycin markers |
| ∆kbl-YR | CCGGATGAATGTCAGCTA | - | |
| tynA-F | TTCTTCAGCGCCCCTAGC | - | Verifying the existence of tynA |
| tynA-R | ATGCTCGACGGCAAACAT | - | |
| ∆tynA-F | GCTCATAAGTAAAAAACGGCGCCTGGTGCCGTTTTTTTAGTCTGAAACAACGTCTTGAGCGATTGTGTAG | - | Obtaining the knockout target fragment of tynA gene from pKD13. |
| ∆tynA-R | TTGCGCTGGAAAACAAACCGGTTGACCAGCCGCGCAAAGCCGACGTCATTGATAAGCTGTCAAACATGAG | - | |
| ∆tynA-YF | ACGGCGCCTGGTGCCGT | - | Verifying the elimination of kanamycin markers. |
| ∆tynA-YR | CGGTTGACCAGCCGCGCA | - | |
| ltaE-F | TCAACGAAACCGGTGAT | - | Verifying the existence of ltaE |
| ltaE-R | GATCTGCCGGTTGCTAT | - | |
| ∆ltaE-F | CTGGATACAATGCTATCTGAAGTACTCATATCCTATCCTCAACGAATTAACGTCTTGAGCGATTGTGTAG | - | Obtaining the knockout target fragment of ltaE gene from pKD13 |
| ∆ltaE-R | GTGTCGGTTACGGTTACCTACATATTTAATTCAGGCGAAGAGGTTTTATAGATAAGCTGTCAAACATGAG | - | |
| ∆ltaE-YF | CGGAATAGGAACTTCAAG | - | Verifying the elimination of kanamycin markers |
| ∆ltaE-YR | CCGGATGAATGTCAGCTA | - | |
| ilvA-F | ATGGCTGACTCGCAAC | - | Verifying the existence of ilvA |
| ilvA-R | CTAACCCGCCAAAAAGAAC | - | |
| ∆ilvA-F | AGCGCCGACAAAGGTGCGGTGCGCGATAAATCGAAACTGGGGGGTTAATGCGTCTTGAGCGATTGTGTAG | - | Obtaining the knockout target fragment of ilvA gene from pKD13 |
| ∆ilvA-R | GTTGTCGCGCGGGTAGGCCTGATAAGCGAAGCGCTATCAGGCATTTTTCCGATAAGCTGTCAAACATGAG | - | |
| ∆ilvA-YF | GTGCGGTGCGCGATAAAT | - | Verifying the elimination of kanamycin markers |
| ∆ilvA-YR | GCGCGGGTAGGCCTGAT | - | |
| Note: the letters with underline represent cleavage sites and the bold letters represent the homologous sequence of the target genes. | |||
Luria-Bertani (LB)培养基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L和NaCl 10 g/L，pH 7.0。Terrific-Broth (TB)培养基：胰蛋白胨12 g/L、酵母提取物24 g/L、甘油4 mL/L、KH2PO4 2.31 g/L和K2HPO4·3H2O 16.42 g/L，具体配制方法参照李阳等建立的方法进行[14]。M9基础培养基的配制参照Mundhada等建立的方法进行[15]。
转化体系(50 mL)：甘氨酸-NaOH缓冲液(0.05 mol/L甘氨酸+0.032 mol/L NaOH，pH 10.4)，5 g/L L-苏氨酸，菌体OD600=5.0。
1.4 方法1.4.1 苏氨酸脱氢酶基因tdh的克隆及重组菌的构建基于National Center for Biotechnology Information (NCBI)数据库，构建苏氨酸脱氢酶(TDH)系统进化树，并从中挑选20种具有代表性微生物来源的TDH (图 2A)。在GenBank数据库中分别获取20种来源的TDH氨基酸序列，并提交给苏州金唯智生物科技有限公司根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化、合成并连接至表达载体pRSFDuet-1的酶切位点BamHⅠ和EcoRⅠ间，
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| 图 2 不同来源TDH的多样性(A)和SDS-PAGE (B)分析以及对2, 5-DMP合成(C)和L-苏氨酸消耗(D)的影响Fig. 2 Diversity analysis (A) and SDS-PAGE analysis (B) of TDH as well as the 2, 5-DMP accumulation (C) and L-threonine consumption (D) in strains with overexpression of different TDH. |
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图选项
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获得重组质粒pRSFDuet-tdhX (X表示不同微生物来源)。将重组质粒pRSFDuet-tdhX转化至感受态细胞E. coli BL21(DE3)中，通过卡那霉素(Kan)抗性筛选，获得重组菌E. coli BL21/pRSFDuet-tdhX。
1.4.2 NADH氧化酶基因noxE的克隆及重组菌的构建在GenBank数据库中获取乳脂链球菌Lactococcus cremoris MG1363中NADH氧化酶(NoxE)基因序列(登录号AM406671.1)，并提交给苏州金唯智生物科技有限公司根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化、合成并连接至表达载体pRSFDuet-tdhX* (tdhX*代表最佳微生物来源的tdh，编码X*TDH)的酶切位点EcoRⅠ和Hind Ⅲ间，获得重组质粒pRSFDuet-tdhX*-noxELc，或者连接至表达载体pRSFDuet-tdhX*的酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ间，获得重组质粒pRSFDuet-tdhX*-PnoxELc。此外，根据X*TDH氨基酸序列和NoxE氨基酸序列设计融合蛋白，在两者之间加入(GGGGS)×2作为融合蛋白linker，将拼接融合蛋白氨基酸序列提交给苏州金唯智生物科技有限公司根据大肠杆菌密码子偏好性进行优化、合成并连接至表达载体pRSFDuet-1的酶切位点BamHⅠ和Hind Ⅲ间，获得重组质粒pRSFDuet-tdhX*noxELc。分别将重组质粒pRSFDuet-tdhX*-noxELc、pRSFDuet- tdhX*-PnoxELc和pRSFDuet-tdhX*noxELc转化至感受态细胞E. coli BL21(DE3)中，通过Kan抗性筛选，获得重组菌E. coli pRSFDuet-tdhX*- noxELc、E. coli pRSFDuet-tdhX*-PnoxELc和E. coli pRSFDuet-tdhX*noxELc。
1.4.3 苏氨酸转运蛋白SstT基因sstT的克隆及重组菌的构建根据GenBank数据库中的sstT基因序列(登录号AP009048.1)，设计PCR扩增引物，上下游引物分别引入酶切位点NdeⅠ和XhoⅠ，并进行PCR扩增。将纯化后的PCR产物即sstT片段与重组载体pRSFDuet-tdhX*noxE分别用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收目的片段后以T4 DNA连接酶于16 ℃条件下连接12 h。将酶连产物转化至E. coli DH5α感受态细胞，并涂布于含有50 μg/mL Kan的LB平板并于37 ℃培养12 h。挑取单菌落并提取质粒，经NdeⅠ/XhoⅠ双酶切验证得到阳性克隆，并送样进行DNA测序，获得目标重组质粒pRSFDuet-tdhX*noxE-PsstT。
1.4.4 基因kbl、tynA、ltaE和ilvA的敲除E. coli BL21(DE3)中基因的敲除参照Datsenko和Wanner建立的方法进行[16]。具体方法如下：首先，使用pKD13作为PCR模板，将引物∆A-F和∆A-R (A代表需要敲除的目标基因)扩增获得含有基因A的上游和下游同源臂序列、卡那霉素抗性基因kan和2个FRT位点的DNA片段，随后电转入E. coli/pKD46感受态细胞中并于37 ℃孵育2 h后涂布在含有25 μg/mL Kan的LB平板(LBK25)上。培养12 h后挑取单个菌落，使用引物A-F和A-R进行菌落PCR扩增，挑选基因A敲除成功的菌落。最后，为了消除kan基因，将携带FLP重组酶的温敏型质粒pCP20，电转入E. coli BL21ΔA::kan菌株中，42 ℃培养12 h后稀释并涂布在LB固体培养基上。挑取单个菌落，分别点种在LBK25平板和LB平板，37 ℃培养12 h，挑取仅能在LB平板上生长的单菌落用引物∆A-YF和∆A-YR进行菌落PCR验证，片段大小正确即为目标菌株E. coli BL21ΔA。
1.4.5 酶活性的测定菌株含有50 μg/mL Kan的LB液体培养基中于37 ℃、100 r/min条件下诱导培养16 h。随后，4 ℃、8 000 r/min离心收集菌体。收集的菌体用用0.85%生理盐水洗涤2次。TDH测定时，将菌体悬浮于含150 mmol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L，pH 8.0)中并超声波破碎制备粗酶液并用于TDH的测定，具体测定方法参照Zhang等建立的方法进行[3]。NoxE测定时，将菌体悬浮于含有2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L二硫苏糖醇的磷酸盐缓冲液(100 mmol/L，pH 7.5)并超声波破碎制备粗酶液并用于NoxE的测定，具体测定方法参照Kim等建立的方法进行[17]。
1.4.6 细胞培养与全细胞转化LB培养基和TB培养基都用于培养大肠杆菌，其中前者培养的菌体基因操作，培养时间10–12 h；后者培养的菌体用于细胞转化，培养时间养24 h。非特殊说明，培养温度为37 ℃、转速为100 r/min、接种量为1% (V/V)。在合适的情况下，添加终浓度为50 μg/mL的Kan或/和终浓度为0.5 mmol/L的诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。
全细胞转化时，菌体培养24 h后经5 000 r/min、4 ℃离心7 min收集菌体，并用生理盐水洗涤2次，最后用15 mL甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 10.4)重悬菌体。非特殊说明，转化温度为37 ℃、转速为200 r/min。
1.4.7 高效液相法定性定量分析采用Waters超高效液相色谱仪(UPLC)对2, 5-DMP进行定量检测，具体方法参照Zhang等建立的方法进行[3]。其中流动相A为0.1% (W/V)甲酸溶液，流动相B为0.1% (W/V)甲醇溶液，流速0.2 mL/min，检测波长为275 nm。取2, 5-DMP标准品配制成不同浓度梯度，绘制标准曲线并计算回归方程，将测得的样品数值代入回归方程，确定2, 5-DMP浓度。
2 结果与分析2.1 筛选最佳苏氨酸脱氢酶(TDH)，促进L-苏氨酸有效转化2, 5-DMP根据NCBI中蛋白质数据库中关于TDH记录可知(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=Threonine+dehydrogenase)，截至目前不少于210 000种TDH被报道。然而，前人研究发现不同微生物来源的TDH具有不同的底物亲和性和最适作用温度[3, 8, 18]。为了获得能在大肠杆菌中有效催化2, 5-DMP合成的最佳TDH，本研究基于蛋白质系统进化树选择了20种具有代表性微生物来源的TDH进行克隆表达(图 2A)，并考察其对2, 5-DMP产量的影响。
研究结果表明，所选择的20种不同微生物来源的TDH经密码子优化后都可以在E. coli BL21(DE3)中表达，蛋白质分子大小约为37 kDa (图 2B)。酶活性分析发现，不同来源的TDH都表现出TDH酶活性，但是来源于嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophica ATCC7966、超好热始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1和Thermoplasma volcanium GSS1的TDH酶活性很低(≤6.0 mU/mg蛋白，表 3)。在这20种不同来源的TDH中，来源于E. coli MG1655中的EcTDH表现出最高酶活力，比酶活力达到(124.5±7.4) mU/(mg蛋白)。此外，不同微生物来源的TDH表达菌株积累2, 5-DMP能力也具有显著性差异。在含有5 g/L L-苏氨酸转化体系中全细胞转化24 h，来源于E. coli MG1655中的EcTDH表达菌株E. coli pRSFDuet-tdhEc (即Ec/TDHEc)积累2, 5-DMP浓度最高(438.3±23.7 mg/L)，且消耗L-苏氨酸量最高(图 2C–D)。然而，来源于A. hydrophica ATCC7966、T. kodakaraensis KOD1和T. volcanium GSS1的TDH表达菌株中2, 5-DMP积累量和L-苏氨酸消耗量与出发菌株无明显变化(图 2C–D)。综合上述结果，在E. coli过表达来源于E. coli MG1655中的EcTDH可以实现有效催化L-苏氨酸合成2, 5-DMP。
| Strains | TDH (mU/mg protein) | NoxE (mU/mg protein) | |
| NAD+ | NADH | ||
| E. coli BL21(DE3) | 3.1±0.2 | < 1 | 18.6±2.5 |
| E. coli pRSFDuet-tdhAh | 4.5±1.3 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhBmu | 38.9±3.6 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhBma | 22.5±2.5 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhBl | 99.1±7.3 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhBa | 85.3±6.9 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhBs | 94.8±10.2 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhCc | 64.1±3.5 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhCg | 63.4±4.7 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhFp | 97.0±5.4 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhPp | 70.1±5.9 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhPh | 4.8±1.9 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhSpe | 47.5±4.6 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhSpu | 41.4±4.3 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhTk | 6.0±1.6 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhTv | 5.2±1.1 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhVt | 23.2±1.7 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhXc | 34.6±4.3 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhSe | 57.9±6.6 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhEf | 65.2±5.5 | < 1 | - |
| E. coli pRSFDuet-tdhEc | 124.5±7.4 | < 1 | 19.5±1.8 |
| E. coli pRSFDuet-tdhEc-noxELc | 125.2±16.6 | 108.4±9.1 | 278.3±26.6 |
| E. coli pRSFDuet-tdhEc-PnoxELc | 134.1±12.2 | 127.5±13.4 | 334.5±34.1 |
| E. coli pRSFDuet-tdhEcnoxELc | 125.4±11.7 | 125.0±12.3 | 295.3±23.4 |
| Ah: A. hydrophica ATCC7966; Cc: C. crenatum MT; Cg: Corynebacterium glutamicum ATCC13032; Bmu: Burkholderia multivorans ATCC17616; Bma: B. mallei ATCC23344; Bl: Bacillus licheniformis ATCC14580; Ba: B. amyloliquefaciens Y2; Bs: B. subtilis 168; Fp: Francisella philomiragia ATCC25017; Pp: Paenibacillus polymyxa ATCC842; Ph: Pyrococcus horikoshii OT3; Spe: Shewanella pealeana ATCC700345; Spu: S. putefaciens CN-32; Se: Salmonella enterica ATCC9150; Tk: T. kodakaraensis KOD1; Tv: T. volcanium GSS1; Vt: vibrio transmaniensis LGP32; Xc: Xanthomonas campestris 8004; Ef: Escherichia fergusonli ATCC35469; “-”: no detection. | |||
EcTDH是以NAD+为辅因子催化L-苏氨酸氧化脱氢生成2-氨基-3-酮丁酸。因此，每合成1 mol 2, 5-DMP，需消耗2 mol NAD+，同时产生2 mol NADH。NADH氧化酶(NoxE)催化NADH氧化成NAD+，同时将O2还原成H2O[19]。为了满足2, 5-DMP合成过程中对NAD+的需要以及平衡胞内NADH/NAD+水平，本研究异源表达了来源于L. cremoris MG1363中NoxE，并考察了LcNoxE不同表达方式对2, 5-DMP合成的影响。pRSFDuet-1具有两个多克隆位点(MCS)，且每一个多克隆位点由T7启动子、lac操纵子和一个核糖体结合位点(RBS)组成。根据质粒pRSFDuet-1的特点，本实验通过将密码子优化后的目标基因noxELc插入到不同MCS位点处或者将EcTDH与LcNoxE组成融合蛋白，从而获得不同LcNoxE表达方式重组质粒pRSFDuet-tdhEc-noxELc、pRSFDuet-tdhEc- PnoxELc和pRSFDuet-tdhEcnoxELc (图 3A)。随后，分别将重组质粒pRSFDuet-tdhEc-noxELc、pRSFDuet-tdhEc-PnoxELc和pRSFDuet-tdhEcnoxELc转化至宿主细胞E. coli BL21(DE3) (即EcBL21)中，获得重组菌E. coli pRSFDuet-tdhEc-noxELc (即Ec/TDHEc-NoxELc)、E. coli pRSFDuet-tdhEc-PnoxELc (即Ec/TDHEc-PNoxELc)和E. coli pRSFDuet-tdhEcnoxELc (即Ec/TDHEcNoxELc)。与菌株Ec/TDHEc比较，上述3株重组菌在LB和TB液体培养基的生长受到一定的抑制，其中菌株Ec/TDHEc-PNoxELc生物量降低明显(图 3B)。对不同重组菌株蛋白表达情况进行SDS-PAGE分析表明，在37 kDa、50 kDa和90 kDa附近有明显加粗的蛋白条带，说明菌株中EcTDH和LcNoxE均表达(图 3C)。
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| 图 3 不同NoxE表达方式重组质粒的构建(A)及其对菌体生长(B)、表达水平(C)、2, 5-DMP积累(D)、L-苏氨酸消耗(E)和菌体存活率(F)的影响Fig. 3 Construction of plasmids with overexpression of NoxE in different expression mode (A) and its effects on cell growth (B), expression level (C), 2, 5-DMP accumulation (D), L-threonine consumption (E) as well as cell survival (F). |
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图选项
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此外，上述3株重组菌株均能检测到EcTDH和LcNoxE酶活力，其中重组菌Ec/TDHEc-PNoxELc表现出最高的EcTDH和LcNoxE酶活力，而重组菌Ec/TDHEc-NoxELc酶活力最低(表 3)。需要指出的是，将TDH酶活测定体系中的NAD+换成NADH时，依然能检测到上述3株重组菌中TDH酶活性，而出发菌EcBL21和重组菌Ec/TDHEc未能检测到(表 3)。这些结果表明，异源表达LcNoxE可以有效催化NADH转化形成NAD+，从而满足TDH对辅因子的需求。随后，对上述3株重组菌进行全细胞催化合成2, 5-DMP实验，每8 h测定转化体系中L-苏氨酸残留量和2, 5-DMP生成量，结果如图 3D所示。从图中可以看出，菌株Ec/TDHEc- NoxELc、Ec/TDHEc-PNoxELc和Ec/TDHEcNoxELc中2, 5-DMP的积累量明显高于菌株Ec/TDHEc，表明LcNoxE促进EcTDH催化L-苏氨酸合成2, 5-DMP。菌株Ec/TDHEcNoxELc利用5 g/L L-苏氨酸转化24 h，最终2, 5-DMP产量可达(605.1±56.4 mg/L)，与菌株Ec/TDHEc相比产量增加了38.1% (图 3D)。此外，菌株Ec/TDHEc-NoxELc、Ec/TDHEc-PNoxELc和Ec/TDHEcNoxELc对L-苏氨酸消耗量也要高于菌株Ec/TDHEc，其中菌株Ec/TDHEcNoxELc消耗量最高，达到(3.1±0.2) g/L (图 3E)。
2.3 阻断2, 5-DMP合成途径代谢支路，降低副产物积累量从2, 5-DMP合成途径可知(图 1)，每mol L-苏氨酸可以合成0.5 mol 2, 5-DMP，理论产物得率为0.454 g/(g L-苏氨酸)。然而，从图 3D和图 3E可知，利用菌株Ec/TDHEcNoxELc全细胞催化合成2, 5-DMP时，L-苏氨酸的产物得率仅为0.195 g/(g L-苏氨酸)，远低于理论产物得率水平。对转化后体系中副产物分析发现，体系除了积累了目标产物2, 5-DMP外，还积累了一定量的甘氨酸(图 4A)。从图 1可知，2, 5-DMP前体物2-氨基-3-酮丁酸和α-氨基丙酮分别在KBL和PrAO催化作用下，分别裂解形成甘氨酸和脱氨形成丙酮醛。为了降低副产物的积累量，本实验采用Red重组技术同时敲除了EcBL21中KBL和PrAO编码基因kbl和tynA，获得重组菌E. coli Δkbl ΔtynA (即EcΔkΔA)。与菌株EcBL21相比，菌株EcΔkΔA生长状况无明显变化(图 4B)，但是2, 5-DMP积累量有一定的提高，且甘氨酸积累量显著降低(图 4A和4C)。随后，将重组质粒pRSFDuet-tdhEcnoxELc电转到EcΔkΔA，获得重组菌EcΔkΔA pRSFDuet-tdhEcnoxELc (即EcΔkΔA/TDHEcNoxELc)。重组菌EcΔkΔA/ TDHEcNoxELc 2, 5-DMP积累量从(605.1±56.4) mg/L提高至(908.4±93.9) mg/L，L-苏氨酸的产物得率从0.195 g/g L-苏氨酸提高到0.275 g/g L-苏氨酸，比菌株Ec/TDHEcNoxELc分别提高了50.1%和41.0%。虽然重组菌EcΔkΔA/TDHEcNoxELc 2, 5-DMP积累量和L-苏氨酸的产物得率都有显著提高，但是其L-苏氨酸消耗量仅为(3.3±0.4) g/L (图 4D)。
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| 图 4 失活KBL和PrAO以及过表达SstT对副产物积累(A)、菌体生长(B)、2, 5-DMP积累(C)和L-苏氨酸消耗(D)的影响Fig. 4 The effects of inactivation of KBL and PrAO as well as overexpression of SstT on by-products accumulation (A), cell growth (B), 2, 5-DMP accumulation (C) and L-threonine consumption (D). |
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图选项
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如前所述，EcΔkΔA/TDHEcNoxELc L-苏氨酸消耗量仅为(3.3±0.4) g/L，这或许是限制2, 5-DMP产量的一个因素。为此，本研究过表达了参与L-苏氨酸转运的转运蛋白SstT，并考察了重组菌E. coli Δkbl ΔtynA pRSFDuet-tdhEcnoxELc-PsstT (即EcΔkΔA/TDHEcNoxELc-PSstT) L-苏氨酸消耗量和2, 5-DMP产量的变化。从图 4D可知，重组菌EcΔkΔA/TDHEcNoxELc-PSstT L-苏氨酸消耗量从(3.3±0.4) g/L提高至(4.3±0.3) g/L，比菌株EcΔkΔA/ TDHEcNoxELc提高了30.3%。然而，重组菌EcΔkΔA/ TDHEcNoxELc-PSstT 2, 5-DMP积累量并没有显著提高，比菌株EcΔkΔA/TDHEcNoxELc仅提高了6.9% ((971.3±46.5) mg/L vs (908.4±93.9) mg/L，图 4C)。此外，重组菌EcΔkΔA/TDHEcNoxELc-PSstT还积累了(41.0±3.0) mg/L的甘氨酸(图 4A)。
2.5 减少L-苏氨酸分解代谢途径，提高L-苏氨酸转化效率在大肠杆菌中除了TDH参与L-苏氨酸分解代谢外，TA和TD也参与L-苏氨酸分解代谢，最终形成甘氨酸和L-异亮氨酸。为了提高L-苏氨酸的转化效率，本研究通过敲除菌株EcΔkΔA/ TDHEcNoxELc-PSstT中TA和TD，减少L-苏氨酸其他分解代谢途径，使得菌株只能通过TDH分解L-苏氨酸形成2-氨基-3-酮丁酸参与2, 5-DMP的合成。失活TD，菌体生长受到一定影响，尤其在M9基础培养基上培养时，TD失活菌株不能生长，除非添加0.5 g/L L-异亮氨酸。重组菌E. coli Δkbl ΔtynA ΔltaE ΔilvA pRSFDuet-tdhEcnoxELc-PsstT (即EcΔkΔAΔBΔA/TDHEcNoxELc-PSstT)中2, 5-DMP积累量达到(1 095.7±81.3) mg/L，比菌株EcΔkΔA/ TDHEcNoxELc-PSstT和EcΔkΔA/TDHEcNoxELc分别提高了12.8%和20.6% (图 5A)。虽然重组菌EcΔkΔAΔBΔA/TDHEcNoxELc-PSstT中L-苏氨酸消耗量低于菌株EcΔkΔA/TDHEcNoxELc-PSstT (图 5B)，但是其2, 5-DMP产物得率达到0.288 g/(g L-苏氨酸)。
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| 图 5 失活TA和TD对2, 5-DMP积累(A)和L-苏氨酸消耗(B)的影响Fig. 5 The effects of inactivation of TA and TD on 2, 5-DMP accumulation (A) and L-threonine consumption (B). |
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图选项
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作为烷基吡嗪类化合物中的重要一员，2, 5-DMP在食品香料与医药方面具有重要的经济价值[2-3]。目前，工业上普遍采用化学合成法生产2, 5-DMP[4]。相对于化学合成法，微生物合成法具有反应条件温和和环境友好的特点，且产品是天然的，因此更受消费者喜爱。然而，由于微生物合成法合成2, 5-DMP的产量很低，常被研究者忽视，所以目前关于这方面的报道还很少[4, 6, 20]。本研究首次结合代谢工程和辅因子工程策略设计了可高效催化L-苏氨酸合成2, 5-DMP的全细胞催化剂EcΔkΔAΔBΔA/TDHEcNoxELc-PSstT。该菌株在含有5 g/L L-苏氨酸的转化体系中于37 ℃、200 r/min孵化24 h，可积累(1 095.7±81.3) mg/L的2, 5-DMP，2, 5-DMP产物得率达到0.288 g/(g L-苏氨酸)。
以L-苏氨酸为底物合成2, 5-DMP时，TDH是第一个关键酶，也是第一个限速酶。本研究在考察20种具有代表性微生物来源的TDH时发现，尽管在E. coli中不同来源的TDH都可以表达，但是不同来源的TDH都表现出TDH酶活力大小不一(表 3)。这一结果与曹艳丽等报道的不同，她们发现有些微生物来源的TDH不能在B. subtilis中正常表达，原因是因为供体菌株与宿主菌株亲缘关系相距较远[20]。然而，不同微生物来源的TDH具有不同的底物亲和性和最适作用温度[3, 8, 18]，这也许是在现有的TDH酶活性测定条件下酶活力大小不一的原因。与酶活力结果一致，不同微生物来源的TDH表达菌株积累2, 5-DMP能力也具有显著性差异，其中来源于E. coli MG1655中的EcTDH表达菌株Ec/TDHEc积累2, 5-DMP浓度最高((438.3±23.7) mg/L)，且消耗L-苏氨酸量最高(图 2C–D)。这一结果与曹艳丽等报道的一致，他们发现过表达EcTDH的重组菌B. subtilis 168/pMA0911-tdh (E.c)在含有5.83 g/L L-苏氨酸的LB液体培养基中发酵24 h可积累527.43 mg/L的2, 5-DMP[20]。这些结果表明，来源于E. coli MG1655中的EcTDH可以实现有效催化L-苏氨酸合成2, 5-DMP。
来源于E. coli中的EcTDH是以NAD+为辅因子参与L-苏氨酸还原反应。研究发现，重组菌Ec/TDHEc在转化后期2, 5-DMP合成能力明显不足(图 3D)，其原因可能是辅因子NAD+不足，从而影响EcTDH酶活力。此外，对不同转化时间后菌体存活率分析发现，重组菌Ec/TDHEc在转化后期细胞大量裂解死亡，而重组菌Ec/TDHEcNoxELc却保持较高的存活率(图 3F)。有研究指出，胞内NADH/NAD+水平在微生物生长中发挥多种生理功能，影响细胞功能[21]。由于重组菌Ec/TDHEc持续消耗胞内NAD+而积累NADH，从而造成胞内NADH/NAD+不平衡，从而影响细胞功能。相反，表达来源于L. cremoris MG1363中LcNoxE，可以催化NADH合成NAD+，从而平衡胞内NADH/NAD+水平。除了具有较高的细胞存活率外，重组菌Ec/TDHEcNoxELc也表现出高的2, 5-DMP积累量，产量达到(605.1±56.4) mg/L。相似结果也发现在利用酿酒酵母构建高产2, 3-丁二醇重组菌株的研究中[17]。
尽管通过耦合表达EcTDH和LcNoxE可以显著提高2, 5-DMP产量，但是2, 5-DMP产物得率仍然远低于理论产物得率水平[0.195 g/(g L-苏氨酸) vs 0.454 g/(g L-苏氨酸)][4]。以L-苏氨酸为底物合成2, 5-DMP代谢途径中存在许多代谢支路(图 1)，如KBL参与催化的甘氨酸合成途径、PrAO参与催化的丙酮醛合成途径以及L-苏氨酸其他两个分解代谢途径。这些支路途径的存在都可能影响2, 5-DMP产量，降低L-苏氨酸转化率。研究发现，通过阻断上述支路代谢途径，可以显著减少副产物积累，增加2, 5-DMP产量，同时提高L-苏氨酸转化率(图 4–5)。本研究最终获得的重组菌EcΔkΔAΔBΔA/TDHEcNoxELc-PSstT中2, 5-DMP产物得率达到0.288 g/(g L-苏氨酸)，2, 5-DMP收率达到了48.2%，高于曹艳丽等报道的产物得率0.232 g/(g L-苏氨酸)和23.3%的2, 5-DMP收率[20]以及Larroche等报道的2.5%的2, 5-DMP收率[6]。因此，利用重组菌EcΔkΔAΔBΔA/TDHEcNoxELc- PSstT直接全细胞转化L-苏氨酸合成2, 5-DMP具有很大优势。
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