多杀菌素，又名刺糖菌素，是土壤放线菌刺糖多孢菌经有氧发酵产生的次级代谢产物，属大环内酯类化合物。可有效防治鳞翅目、双翅目、缨翅目、鞘翅目及膜翅目等多种害虫。多杀菌素及其衍生物兼有生物农药的安全性和化学合成农药的速效性，因其具有低毒、低残留、对人安全、对非靶标动物和环境安全、自然分解快等优点，曾先后于1999年、2008年、2010年三次获得美国“总统绿色化学品挑战奖(Presidential Green Chemistry Challenge Award)”。
我国对多杀菌素的研究还处于试验阶段，尚无工业化生产的相关报道。现阶段多杀菌素的研究热点主要集中在全合成和分子改造上。国内多杀菌素发酵水平较低，需进一步选育高产菌株，提高发酵工艺水平。本研究利用30L及50L发酵罐对经过多次诱变选育获得的多杀菌素高产菌株进行培养基配方改良和发酵工艺优化，研究补料发酵工艺，为多杀菌素的工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 仪器设备
15L发酵罐，德国satorius集团；30L及50L发酵罐，镇江东方生物工程设备有限公司；SBM/SS－X摇床，瑞士Kuhner公司；Nova BioProfile 300多参数分析仪，美国Nova公司；Waters515/2487型高效液相色谱仪，美国Waters公司。
1.2 菌种与培养基
1.2.1 菌种
刺糖多孢菌ASAGF73，本实验室保存。
1.2.2 培养基
斜面及平板培养基(g/L):葡萄糖5.0，牛肉膏3.0，酪蛋白胨0.25，琼脂18.0。pH 7.2。
种子培养基(g/L):葡萄糖15.0，可溶性淀粉10.0，豆饼粉3.0，棉籽蛋白3.0，大豆蛋白胨25.0，MgSO4 2.0。pH 7.2。
发酵培养基(g/L):葡萄糖70.0，棉籽粉20.0，NaCl 3.0，K2HPO4·3H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.05，CaCO3 1.0。大豆油3mL/L，pH 7.0。
上述培养基12l℃灭菌30min，葡萄糖单独115℃灭菌25min。
发酵罐培养基同摇瓶，培养基121～124℃在位灭菌30min。灭菌后pH在6.5～7.0之间。
培养条件:接种量10%，培养温度29℃，摇瓶转速为240r/min，发酵罐通过搅拌将溶氧控制在40%以上。
1.3 实验方法
1.3.1 基础培养基优化
本实验利用摇瓶在原发酵培养基的基础上添加0.3%～0.7%的酵母提取物及0.4%～1.6%玉米浆干粉进行氮源优化。
1.3.2 补料发酵工艺优化
1.3.2.1 pH的优化
流加稀盐酸调节pH，将pH分别控制在6.5、7.0、7.5和8.0。
1.3.2.2 残糖水平优化
补料工艺中，将基础葡萄糖添加量由60g/L降至30g/L，将残糖控制在不同水平，对照为原工艺。
1.4 相关参数检测
(1)糖、氮的测定:总糖测定参照山东科学院SGD－Ⅳ全自动还原糖测定仪仪器说明书；葡萄糖及氨态氮测定参照Nova BioProfile 300多参数分析仪仪器使用说明书。
(2)生物量的测定:PMV法，发酵液4000r/min离心15min，计算沉淀固体占发酵液的质量百分比。
(3)多杀菌素发酵产量的测定:取发酵液2mL，加入无水甲醇4mL，充分振荡30min，转速4000r/min离心10min，上清14000r/min离心5min，上清液用HPLC测定多杀菌素的产量。色谱条件:waters高效液相色谱仪:C18反相柱(250mm×4.0mm)；流动相为甲醇∶乙腈∶水=45∶45∶10(v/v/v，其中水含0.05%乙酸铵)；流速1.0mL/min；检测波长244nm；进样量10μL；柱温25℃。
2 结果与分析
2.1 基础培养基优化
由于多杀菌素发酵属于部分生长偶联型发酵，且主要在稳定期合成多杀菌素，因此，只有生物量达到一定量之后，发酵后期多杀菌素产量才能进一步提高。刺糖多孢菌ASAGF73在发酵过程中生长缓慢、延滞期长。酵母提取物和玉米浆干粉营养丰富，常作为速效有机氮源，适量添加酵母提取物和玉米浆干粉有利于菌丝生长。因此在本实验中以生物量为主要目标在不影响前期发酵产量的前提下进行了酵母提取物及玉米浆干粉的筛选。
2.1.1 酵母提取物对生物量及多杀菌素产量的影响
发酵配方中分别添加质量分数为0.3%的酵母浸膏和酵母浸粉，对照为不添加酵母提取物。
结果表明，酵母提取物有利于菌体的生长，在添加酵母提取物的各组中，生物量及多杀菌素产量均大于不添加酵母提取物的对照组(表1)。另与酵母浸粉相比较，酵母浸膏更有利于发酵产量的增长。
酵母浸膏最适浓度的筛选结果见表2。胞内代谢产物的产量受生物量影响较大，生物量提高，后期产素相应提高，由表2可知，在酵母浸膏浓度为0.5%时，生物量最大，此时多杀菌素发酵产量最高。所以采用0.5%的酵母浸膏。
2.1.2 玉米浆干粉对生物量及多杀菌素产量的影响
在固定0.5%酵母浸膏的基础培养基中，添加不同比例的玉米浆干粉。分别培养不同时间后测定生物量及产量，结果如表3所示。摇瓶筛选结果表明添加一定量的玉米浆干粉有利于菌丝生长。随着玉米浆干粉浓度的不断增加，生物量及产量先呈上升趋势，在浓度为1.0%时都达到最高。但是速效氮源也存在类似于葡萄糖的阻遏效应，随着玉米浆干粉的继续增加，生物量的变化表现出抑制作用。
通过上述摇瓶筛选，在原有发酵培养基的基础上，添加0.5%酵母浸膏和1.0%的玉米浆干粉作为初始发酵培养基进行发酵罐实验。
2.2 补料发酵工艺优化
发酵过程中过高或者过低的pH均会对微生物的生长及代谢造成不同程度的影响。多杀菌素发酵过程中发酵液pH波动较大，在发酵过程中逐渐升高，高峰达到8.6，可能影响多杀菌素的合成。因此需要调节pH来选择其最适范围。此外，原有工艺为分批发酵，基础含糖量高，整个发酵过程中残糖维持较高水平，当发酵至230h时，残糖仍在20g/L以上。高糖不但影响溶氧水平，还会对产物的合成造成一定的影响。因此在补料工艺中，对残糖的控制范围进行了确定。
2.2.1 pH的优化
在不控制pH时，在发酵中后期pH维持在8.0以上，pH水平过高，影响了多杀菌素的合成，250h放罐时的发酵单位仅为575μg/mL(图1)。当用稀盐酸将pH控制在不同水平时，发现过高及过低的pH对多杀菌素的合成也有一定影响。根据上述结果，确定通过流加稀盐酸，将pH控制在7.0～7.5之间时，多杀菌素产量达到最高。
2.2.2 残糖水平优化
以葡萄糖作为主要碳源和能源生产抗生素时容易导致葡萄糖效应，抑制次级代谢产物的合成，所以一般采用葡萄糖的补料或流加来减少其抑制作用。图2、图3结果表明，残糖全程控制在相对稳定较低的水平，生物量在100h左右达到最大，缩短了迟滞期，抗生素合成起步单位较对照提前24h。250h发酵单位达到1050μg/mL，较对照提高82%。
3 结论
培养基的优化通常是发酵工艺优化的第一步。玉米浆和酵母浸膏作为速效氮源，含有微生物生长和代谢所必需的氮源、微量元素、维生素等。本研究结果表明，添加酵母浸膏和玉米浆干粉之后，菌丝前期生长速率加快，延滞期缩短，生物量明显提高，为后期多杀菌素产量的提高奠定了基础。
张竞立、朱明军等人通过分批发酵动力学研究发现弱酸条件有利于菌体生长，且得出多杀菌素的发酵是一个部分生长相关型发酵，合成多杀菌素主要在稳定期。本研究的结果表明，pH控制在7.0～7.5之间时，多杀菌素产量达到最高，说明中性偏弱碱条件更有利于刺糖多孢菌产多杀菌素，与代鹏等的研究结果一致。
前期培养基优化结果表明，葡萄糖是刺糖多孢菌产多杀菌素的最适碳源。但是以葡萄糖作为主要碳源和能源生产抗生素时容易导致葡萄糖效应，抑制次级代谢产物的合成，所以一般采用葡萄糖的补料或流加来减少其抑制作用。本研究将残糖控制在5～15g/L之间，抗生素合成起步单位较对照提前24h，250h发酵单位达到1050μg/mL，较对照提高82%。可见，控制残糖量在合适的水平，是补料发酵工艺的关键。
