为了筛选产生吡咯喹啉醌，英文名为pyrroloquinoline quinone（PQQ）的菌株并提高PQQ发酵产量，该研究建立了一种快速的高效液相色谱法检测PQQ，并采用了以甲醇为唯一碳源的选择性培养基，利用光谱法对样品进行初筛，高效液相色谱法（HPLC）对初筛得到的结果再进行复筛。该研究还对筛选得到的菌株发酵产PQQ的培养基进行了优化。研究结果显示：从样品中筛选得56株PQQ产生菌，摇瓶产量最高的一株为20.6 mg /L，通过16s rDNA 测序分析，鉴定该菌株为Methylopila sp.属。对培养基成分中的碳源甲醇进行了优化研究，当甲醇体积浓度为2.5%时，PQQ产量最高，为26.3 mg /L，相比于初始甲醇1.0%提高了28%。该研究建立的高效液相色谱法为PQQ高产菌株的筛选提供一种快速检测方法，筛选到的菌株具有较高的甲醇耐受力和PQQ生产潜力，为之后的PQQ发酵研究提供参考。
吡咯喹啉醌，英文名为pyrroloquinoline quinone（PQQ），作为许多细菌脱氢酶（甲醇脱氢酶，乙醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶等）的辅助因子于1964年首次被发现，它是继吡啶核苷酸和核黄素之后的第三种氧化还原酶的辅酶。PQQ在生物界的分布极为广泛，在动植物和微生物细胞中均发现其存在，但仅有部分革兰氏阴性细菌能合成PQQ。
在具有合成PQQ能力的细菌中，绝大部分只能合成痕量的PQQ以供给细胞生长，只有少部分可以生产过量的PQQ，并将其排泄到培养基中，其中以甲基营养菌的合成能力最强，如甲基菌属（Methylobacill），甲基单胞菌属（Methylomonas），嗜甲基菌属（Methylophilus）和甲基杆菌属（Methylobacterium）等。此外，在纳豆，青椒和猕猴桃等植物体内也含有微量的PQQ，并且牛奶和人类的母乳中也存在较高浓度的PQQ。近几十年来的研究发现PQQ具有多种生理功能，它是许多细菌脱氢酶的辅助因子，参与细胞的电子呼吸链传递；PQQ可以提高微生物细胞的抗逆性，并提高宿主菌的抗氧化能力[18]；PQQ还是动植物刺激或生长因子；此外，PQQ与葡萄糖脱氢酶结合形成PQQ-GDH全酶，可用作检测葡萄糖的生物传感器，也可用作生物燃料电池。
由于目前PQQ化学合成步骤复杂，副产物多，而微生物发酵生产PQQ成本低，步骤少，产物分离更容易，因此微生物发酵法成为最有前景的工业化生产路线。虽然对PQQ的研究已有几十年，但其生物合成的具体过程尚未完全阐明，从环境中筛选高产野生菌依然是必不可少的。1992年，URAKAMI等筛选到一株PQQ产生菌，经鉴定为生丝微菌Hyphomicrobium sp.TK0441，优化培养基后在30 L发酵罐上发酵14天后PQQ产量可达到1 g/L。司振军等[22]从土壤中筛选到一株甲基营养菌，经鉴定为Methylobacillus sp.zju323,未经优化的PQQ摇瓶产量为23.2 mg/L，在已报道的研究中属于高水平。本研究建立了一种高效液相色谱法用来快速检测PQQ，并从土壤样品中筛选得到一株PQQ高产菌，并对其进行了菌种鉴定和培养基优化，为后续进行PQQ的进一步生产研究提供依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
细菌样品来自于无锡生产甲醇工厂附近的土壤和污水。PQQ标准品购自于Sigma公司，其他试剂均购自于国药集团。
1.2仪器与设备
G180T灭菌锅，美国致微仪器有限公司；高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技公司；酶标仪，美国BioTek公司；Agilent-1260高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司。
1.3培养基
筛选培养基：甲醇30 mg /L，(NH4)2SO4 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L ，KH2PO4 1.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。固体培养基添加2%的琼脂粉。
种子培养基：甲醇10 mg /L，(NH4)2SO4 3 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，KH2PO4 1.4 g/L，微量元素液 1 mL/L。微量元素液：CaCl2·2H2O 30 mg/L，MnCl4·4H2O 5 mg/L发酵培养基：在种子培养基的基础上加入1 mL维生素液，维生素液配方（mg/L）：核黄素200，对氨基苯甲酸200，盐酸硫胺素400，烟酸400，盐酸吡哆醇400，泛酸钙400，叶酸2，生物素2，肌醇2000。
1.4实验方法
1.4.1 PQQ产生菌初筛方法的确立
光谱法：对PQQ标准品进行全波长扫描，发现其在249 nm和330 nm处有两个吸收峰，将200 μ L PQQ标准品溶液或发酵离心上清液转移至96孔板中，用酶标仪检测 OD330与 OD249，并将空白培养基以同样的条件处理和检测，从而减去培养基吸光值的干扰。
1.4.2 HPLC法检测PQQ
由于PQQ的结构上连有3个—COOH，因此其易溶于水，极性较大，在普通的C18反相色谱柱上不保留。目前采用较多的是离子色谱对法来检测PQQ，但是离子色谱对平衡时间长，操作复杂且对柱子也有局限性；还有采用加酸调节pH来使PQQ保留在色谱柱上，但这使得峰形拖尾严重并且重现性不好。为此本实验选择亲水色谱柱来解决PQQ难以在色谱柱上保留的问题。以水为流动相，通过COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色谱柱，测定PQQ在249 nm和330 nm的吸光值，根据出峰面积确定其浓度。利用安捷伦1260系列高效液相色谱仪测定PQQ含量，进样量20 μ L，温度30 ℃，流动相为0.05 mol/L乙酸：0.05 mol/L乙酸铵=30：70，流速1 mL/min，在波长249 nm和330 nm下检测PQQ标准品和样品含量。
1.4.3菌株的筛选
将样品制成适当浓度梯度的稀释液，涂布于甲醇筛选培养基平板上，30 ℃培养3~5天，分别挑取不同形态的单菌落接种到种子培养基中，30 ℃，200 r/min 培养3~5天，将发酵液离心取上清液，用光谱法快速检测PQQ含量，再用HPLC法对PQQ产量较高的菌株进行复筛。
1.4.4菌种的鉴定
将PQQ产量最高的菌株在固体培养基上划线，30 ℃培养3~5天，利用普通光学显微镜观察菌体形态特征。取单菌落接种到摇瓶培养基中，30 ℃培养，当菌体OD600为0.5~1时，取3 mL发酵液，10000 r/min离心1 min，弃去上清液，收集菌体，按照细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）提取DNA，利用细菌通用引物 27F：5'-AGA GTT TGA TCM TGGCTC AG -3'；1492R：5' -GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3'，通过 PCR 反应扩增该菌株的16s rDNA序列，将产物委托上海生工测序，将测序结果在NCBI网站中进行BLAST比对，用软件MEGA进行系统进化树的构建。
1.4.5甲醇含量对菌体生长和PQQ产量的影响
对培养基中的唯一碳源甲醇进行优化，研究甲醇的不同添加体积浓度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）对菌体生长和PQQ产量的影响。
2结果与分析
2.1光谱法检测PQQ
研究建立了基于光谱法检测PQQ的快速筛选方法，通过全波长扫描发现PQQ在249 nm和330 nm左右有两个吸收峰。考虑到发酵液中含有蛋白，核酸等在249 nm左右有吸收值的物质，而在330 nm处有吸收值的物质较少，因此，本实验选择研究PQQ浓度和OD330的关系。通过酶标仪检测不同浓度 PQQ标准品的OD330（检测样品时要减去空白发酵培养基的吸光值以除去干扰），发现在330 nm下PQQ浓度与OD330关系为y=0.0218x-0.0354 (R2=0.9957)。当PQQ浓度在2.5~50 mg/L之间时，二者呈现良好的线性关系，由于野生菌产PQQ量多在1~20 mg/L左右，因此使用本方法进行高通量筛选的初筛具有良好的可行性。
2.2 HPLC法检验PQQ
本试验最先分析了别的离子交换柱检验PQQ，結果发觉一般C18柱没法使PQQ合理保存，拆换流动性相工业甲醇和乙腈，或是是梯度方向过柱都不可以保存PQQ。此外发觉更改pH能够使PQQ有一定的保存，但峰形较弱，且托尾比较严重，而且无法非常好分离出来试品发酵物中的PQQ。充分考虑PQQ正负极很大，因而选用耐100%水的COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反离子交换柱来使PQQ有有效的保存。将准备好的七个不一样含量的PQQ标准物质（100，50，25，12.5，6.125，5，2.5 mg/L）开展HPLC检验，每一个浓度值持续气相3次，每一次气相20 μ L。結果如图所示1所显示。不一样含量的PQQ均在3.56 min上下出峰。伴随着PQQ浓度值的提升，峰总面积也逐步提升。因而PQQ浓度值与峰总面积呈成正比的关联。以PQQ浓度值为横坐标轴，色谱仪峰总面积为纵轴，制作标曲，线性相关为y=30.27x 7.32，R2=0.9998，表明线性相关优良。选用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ正相反离子交换柱检验PQQ，运作时间较短，PQQ出峰時间早，检验高效率。本研究创建的HPLC法检验PQQ具备优良的可行性分析，可做为菌苗产PQQ的复筛方式。
![202109171631892628[1]](https://www.cn-ferment.com/skin/default/image/lazy.gif)
2.3菌种的挑选和评定
经光谱法初筛，从100好几个试样中挑选到50多枝PQQ造成菌，大部分的生产量在2~5 mg/L，极少数能够做到10 mg/L上下，HPLC复筛后在其中PQQ生产量最大的1株为20.6 mg/L，峰图如图2所显示，PQQ在3.57 min出峰，这也是没经提升已报导的摇瓶较高生产量。
该菌种的菌体在工业甲醇培养液平板电脑上为奶白色，浓稠的，边沿齐整，直徑较小，为1~2 mm。菌细胞为球形，革兰氏阳性菌呈阴性，不产芽胞，有荚膜，无微绒毛。该菌种在以工业甲醇和甲胺为氮源的培养液中可以优良生长发育，能运用D-葡萄糖水，绵白糖，葡萄糖和麦芽糖醇。在以氨盐、磷酸盐、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏为氮源的培养液里能较好生长发育。选用PCR技术性增加该菌种的16s rDNA 基因序列，经上海生工转录组测序。根据在 NCBI网址中开展开放阅读框编码序列检索及核对，从这当中选择开放阅读框较高菌种的16s rDNA基因序列，以集团公司外菌苗作对比，根据MEGA手机软件，用临接法（Neighbor-Joining）搭建系统发育树。結果如图所示3所显示，该菌种与 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的开放阅读框最大，为99%。综合性菌体及菌体形状特点、16s rDNA序列剖析，评定该菌种为Methylopila sp.菌种，取名为Methylopila sp.Z1。
2.4 工业甲醇成分的提升
科学研究工业甲醇的差异加上浓度值（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）对OD600和PQQ生产量的危害，結果如图4所显示。在0.5%~2.5%的含量范畴内，伴随着工业甲醇容积含量的提升 ，菌体OD600和PQQ生产量也慢慢提升，当工业甲醇浓度值为2.5%时，OD600和PQQ生产量均实现最大，再次提升工业甲醇浓度值，OD600和PQQ生产量均有显著降低。这是由于工业甲醇做为病菌生長的唯一氮源，而且或是细菌细胞工业甲醇脱氨酶的底物，在其浓度值较低时，不能给予动能使细胞生长，也不能生产制造过多的PQQ代谢到培养液中，造成 PQQ生成高效率极低。当工业甲醇浓度值慢慢增强时，体细胞能够使用的氮源提升，菌体OD600和PQQ生产量也逐步提升；当工业甲醇浓度值超出2.5%时，因为工业甲醇的毒素使体细胞损害，而且底物浓度值过高抑止工业甲醇脱氢酶的活性，造成 菌体OD600和PQQ生产量降低。因而，2.5%的工业甲醇容积浓度值针对菌体生长发育和PQQ生成是最好的选择。
3 结果
现阶段PQQ的检查办法具体有资产重组酶法，氧化还原反应法，光谱法和HPLC，在其中资产重组酶法常用到的葡萄糖水脱氨酶获取繁杂，提纯全过程繁杂，且取得的酶活不高，不能适用很多的菌苗挑选；氧化还原反应法中使用到的铬黑T钛酸异丙酯氟苯四氮唑蓝（NBT）易受培养液中别的成份的影响，导致呈阴性結果。光谱法实际操作简易，检验迅速，但也有可能遭受培养液中有着类似光波长OD值的危害，但本试验使用的是工业甲醇无机物培养液，并根据HPLC检验试品发觉，基本上沒有影响，因而光谱法做为PQQ造成菌的初筛是高效率有效的。本试验还构建了新的HPLC法检验PQQ，选用亲水性离子交换柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ，促使PQQ有有效的保存，而且试品运作时间较短，PQQ在3.56 min出峰，出峰時间早，现场采样短，峰形无托尾，为PQQ检验给予一种新的改善方式。
因为PQQ的微生物生成原理沒有取得彻底诠释，根据基因工程技术和新陈代谢更新改造提升PQQ的生产量远小于野山菌的生产量，因而从自然环境中挑选具备增产PQQ工作能力的菌株是十分必要的。本试验从试品中挑选到一株PQQ增产菌，经评定为Methylopila sp.属，取名为Methylopila_sp. Z1，没经提升的摇瓶生产量做到20.6 mg/L，归属于已报导的较高质量。Z1菌种承受较高工业甲醇，在培养液工业甲醇浓度值为2.5%时，PQQ生产量达26.7 mg/L，对比于原始浓度值提升了28%。Z1是一株有增产PQQ发展潜力的菌种，事后发酵设备塑造和提升加工工艺将进一步提高PQQ生产量。
