摘 要：筛选生丝微菌表达调控研究中最适合的内参基因，为后续大幅度提高吡咯喹啉醌（PQQ）产量打下基础。利用实时荧光定量PCR（Realtime quantitative PCR， RTqPCR）技术分析生丝微菌基因组中6个候选内参基因的相对表达情况，通过Bestkeeper、geNorm和NormFinder软件分析，评价各个生长时期候选内参基因的表达稳定性，确定最合适的内参基因。结果表明：通过对生丝微菌4个不同生长时期的6个候选内参基因（16S rRNA、gapdh、recA、ldh、rpoB和S5）的转录情况进行分析和评估，6个候选内参基因均表现出较强的稳定性和特异性，依据3款软件的综合评价，确定gapdh、recA这两个内参基因在两株菌株不同时期均能稳定表达。从6个候选内参基因中筛选出两个表达稳定的内参基因gapdh基因和recA基因，用于后续生丝微菌的基因表达调控研究。
关键词：吡咯喹啉醌;生丝微菌;内参基因;实时荧光定量PCR
中图分类号：Q93 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2019）11-002
DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2019.11.002
Screening and Validation of Internal Reference Genes of Hyphomicrobium of Pyrroloquinoline Quinone
LIU Mengsu， ZHONG Lufang， KE Chongrong， GAO Min， XIA Huaping， REN Yang， HUANG Jianzhong*
Abstract：The screening of the most suitable internal reference genes for the study on the regulation of the expression of Hyphomicrobium has laid a foundation for greatly increasing the yield of Pyrroloquinoline Quinone （PQQ）. The Realtime quantitative PCR technology was used to analyze the relative expression of 6 candidate reference genes in the genome of Hyphomicrobium. And the softwares of Bestkeeper， geNorm and NormFinder were used to evaluate the expression stability of candidate reference genes in each growth period and determine the most appropriate reference genes. The results showed that through the analysis and evaluation on the transcription situation of the six candidate reference genes （16S rRNA、gapdh、recA、ldh、rpoB and S5） at four different growth periods of Hyphomicrobium， the six candidate reference genes all showed a greater stability and specificity. And according to the comprehensive assessment of the three softwares， it was determined that the two internal reference genes gapdh and recA could be expressed stably in the two strains at different periods. Therefore， the genes gapdh and recA with stable expression were selected from the six candidate reference genes for further study on gene expression regulation of Hyphomicrobium.
Key words： Pyrrologuinoline quinone; Hyphomicrobium; Internal reference gene; Realtime fluorescence quantitative PCR
吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是NAD/NADP和FMN/FAD之后的第三類氧化还原辅因子，是一类重要的醒蛋白辅基[1]。其广泛存在于植物、动物和人体组织器官中，具有明显的抗氧化特性，被广泛地认为是一种高附加价值的生物基化学品[2-3]。生丝微菌作为PQQ的主要生产菌株之一，有必要分析PQQ合成基因的功能，更好的理解PQQ生物合成途径及调控机制，深入探究其生物合成途径中基因表达调控对PQQ产量的提高有重要的意义。
实时荧光定量PCR（RTqPCR）已成为定量研究功能基因组学中基因表达的重要研究工具，可以用于分析细菌、真菌、真核生物等不同生物体中特定基因的转录水平[4]。RTqPCR具有着精确的定量和灵敏度、特异性和可重复性的优点，但要使用RTqPCR分析基因表达，最重要的是选择合适的内参基因[5-7]。目前，已有研究结果表明，RTqPCR结果受到许多因素的影响。例如，反转录效率、所提取RNA的质量、内参基因的稳定性和RTqPCR的扩增效率都将影响试验结果的准确性[8-10]。因此，合适和稳定的内参基因的筛选是保证试验数据可靠的前提。近期研究表明，PQQ更可能是一种抗神经变性、抗癌和药理剂，并且可以作为信号分子起作用[11-12]。PQQ是哺乳动物生长发育和繁殖的必需生长因子，但是其自身并不能合成，只能从外界摄取[13-14]。目前能够生产PQQ的物种包括Klebsiella pneumonia、Acinetobacter calcoaceticus、Methylobacterium extorquens、Gluconobacter oxydans、Enterobacter intermedium、Pseudomonas fluorescens和Pantoea ananatis[15]，但是产量较低，生丝微菌是目前发现生产PQQ产量较高的菌株[16]。此外， PQQ是通过一个特殊的Pqq操纵子基因合成的，研究表明，PQQ生物合成所必需的基因包括PqqA、PqqB、PqqC、PqqD和PqqE[17]。PQQ的合成步骤基本解释清楚，但是PQQ合成基因调控机制还不清楚，并且对于其内参基因的筛选和稳定性表达还鲜有报道。本研究以不同时期生长的生丝微菌作为材料，利用实时荧光定量PCR分析6个候选内参基因，通过Bestkeeper、NormFinder和geNorm综合评估和分析，筛选出合适的内参基因，为后期试验奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
刘孟粟等：产吡咯喹啉醌的生丝微菌内参基因的筛选和验证2019年第11期
2019年第11期刘孟粟等：产吡咯喹啉醌的生丝微菌内参基因的筛选和验证
1.1.1 试验菌株 生丝微菌FJNU6（Hyphomicrobium denitrificans FJNU6 ）不同发酵时间（20、60、100、140 h）的2OD（OD650）菌液（每组3个平行），用DEPC水清洗2遍，用液氮速冻后保存在-80℃冰箱，用于提取RNA。此菌株由福建师范大学发酵工程研究中心分离保藏。
1.1.2 主要试剂与仪器 （1）主要試剂：总RNA提取试剂盒（广州东盛生物科技有限公司），反转录试剂盒Protoscript Ⅱ First Strand cDNA Synthesis Kit[NEB（北京）有限公司]，Trizol、DNaseI酶[宝生物工程（大连）有限公司]，荧光定量试剂盒FastStart Esswntial DNA Green Master（上海罗氏制药有限公司）。（2）主要仪器：恒温摇床（上海智城分析仪器制造有限公司）、5 L发酵罐系统（上海国强生化）、微量分光光度计（Denovix）、紫外可见分光光度计UV 1800（岛津）、BeckMan冷冻离心机（BeckMan Coultek）、Mini T金属浴（Allsheng）、LghtCycler@96罗氏荧光定量PCR仪（Roche）、Analytikjena PCR仪（Analytikjena）等仪器设备。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA提取和cDNA的合成 按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳和Denovix微量分光光度计检测RNA的质量和浓度，用DNA酶消化RNA中残留的基因组，验证无基因组污染后，取5 μg纯化后的RNA根据逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。反应体系（100 μL）：d（T）23 VN 10 μL;Protoscript Ⅱ Enzyme Mix （10×）10 μL;Protoscript Ⅱ Reaction Mix （2×）50 μL;模板RNA 5 μL;最后用Nucleasefree H2O补足体积到100 μL，42℃金属浴孵育1 h，然后在80℃条件下加热5 min使酶失活，反转出的cDNA于-20℃保存用于后续试验，剩余的RNA于-80℃保存。
1.2.2 内参基因选择与引物设计 根据文献，选取6个常用的内参基因：16S rRNA、gapdh、recA、ldh、rpoB、S5作为候选基因[17-19]。结合生丝微菌FJNU6全基因组为模板，用AlleleID 6.0软件设计引物。引物序列、长度和用途见表1。
1.2.3 实时荧光定量PCR 以每个内参基因的cDNA溶液依次稀释10倍、20倍、30倍、40倍后为模板，进行RTqPCR试验。采用罗氏实时荧光定量PCR仪与荧光染料，反应体系（25 μL）：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5 μL、PCR Forward primer 1 μL、PCR Rorward primer 1 μL、RT反应液1 μL、ddH2O 9.5 μL。扩增条件：预变性95℃ 600 s;变性95℃ 10 s;解链58℃ 10 s;延伸72℃ 10 s，进行45个循环，重复3次。
1.2.4 数据处理和分析 使用罗氏的LightCycler
○R 96SW1.1程序分析出引物的扩增效率（表1）。利用Bestkeeper[20]、NormFinder[21]和geNorm[22]软件对6个候选内参基因的稳定性进行评估。BestKeeper程序通过平均Ct值的方差系数（CV）和标准偏差（SD）两个因素确定参考基因的稳定性等级。geNorm是通过统计候选基因的M值大小进而分析候选基因表达稳定性。NormFinder使用基于建模的方法计算组内和组间差异，检测到稳定性最高的参考基因。根据公式（Q=2Ctmax-Ctsample，Q为相对表达量，Ctmax为各样品中最大Ct值，Ctsample为各样品Ct值）计算出相对表达量，最后根据权重重新排列。此外，Ct值的显著性差异采用SPSS的ANOVA（单因素）分析。
2 结果与分析
2.1 生丝微菌FJNU6生长曲线
在5 L罐中发酵培养FINU6，绘制的生长曲线如图1所示（时间为横坐标，OD650为纵坐标）。该曲线描述了丝状微生物在发酵过程中的生长和PQQ合成。从图1可以看出，0～24 h为滞后期，细胞基本处于未生长状态，PQQ没有合成。24～56 h为生丝微菌的对数生长期，菌体开始快速繁殖，PQQ初步合成。56～112 h是菌体进入稳定期，菌体的生长已经趋于平缓，此时PQQ大量合成。112 h后，细菌开始分解进入衰变期。因此，以培养过程中的24 h（细胞生长阶段，PQQ未合成）、48 h（对数生长期、PQQ合成初期）、80 h（细胞生长稳定期）和120 h（细菌衰变期）为培养过程中提取RNA的关键点。
2.2 生丝微菌不同发酵时间总RNA提取
用Denvoix微分光光度计测定提取RNA浓度，A260/A280为1.9～2.0，表明样品纯度高。用1%琼脂糖凝胶电泳法检测总RNA。图2结果表明，所提取的总RNA完整性较好，且未发生降解，符合以下试验要求。
2.3 内参基因引物特异性及荧光定量PCR分析
将各样品的cDNA等体积混合，混合溶液作为模板，通过PCR和凝胶电泳验证内参基因引物的特异性。如图3所示，PCR带是单一的，没有特异性扩增，没有引物二聚体，片段大小与靶片段的大小一致。利用各样品的cDNA作为模板，对6个候选内参基因进行RTqPCR，从图4可以看出，6个候选内参基因的溶解曲线是尖锐的单一信号峰。另外，6个内参基因的特异性更好，反应特异性高，同时，6个内参基因的标准曲线R2大于0.99，表明Ct值与不同浓度cDNA的线性关系良好。另外，同一基因中不同曲线代表不同浓度的cDNA的定量反应后的溶解曲线（图4中的左侧），可见rpoB和16S的差异较小，使得这些基因对浓度的影响较小。gapdh、S5、recA和ldh基因的差异明显，说明模板浓度的大小会影响gapdh、S5、recA和ldh的变化，并且在随后的荧光定量试验中应注意cDNA的浓度。因此，可以用于随后的试验。
2.4 6个候选内参基因稳定性分析
2.4.1 Bestkeeper分析 各候选内参基因的Ct值如表2所示，16S基因的表达水平较高（Ct值低，在6～8），不适合用作内参基因。由表2所得的Ct值，利用Bestkeeper软件分析出Ct值的标准差std（Standard Deviation）和相关性系数r（coeff.of corr）。r值与基因间的相关性有关（r值越大，相关性越高）;而std值与基因稳定性相关（std越小，稳定性越好）。由表3可知，r值：
gapdh>S5>16S>ropB>recA>ldh，std值：gapdh=recA<16S
2.4.2 geNorm分析 根据geNorm软件分析，M值越小，说明候选内参基因在样品中的表达越稳定。图5所示，MS5>MrpoB>Mgapdh>Mldh>M16S=MrecA。其中16S和recA的M值最小，表明在不同时期这两个基因表达最平稳。
通过配对差异值（Vn/Vn+1）确定内参基因数目，Vn/Vn+1的值越小，则差异越小，此时的n值即为所需内参基因的最佳数目。由图6可知，V2/3的值最小，表明最适内参基因数目为2。
通过geNorm软件的统计和分析，根据所得的M值和配对差异值V。16S和 recA可以用作生丝微菌内参基因的最优选择。
2.4.3 NormFinder分析 NormFinder软件是通过计算组内和组间差异来分析基因的表达稳定性。稳定性值（Stability value）越小，表明基因表达越稳定。NormFinder分析结果显示：16S（0.014）、S5（0.021）、rpoB（0.029）、gapdh（0.030）、recA（0.034）、ldh（0.041），所有候选基因的随机表达稳定值（S）均低于参考阀值，都可以作为内参基因使用。
综合Bestkeeper、geNorm和NormFinder分析结果，最终选择gapdh与recA作为生丝微菌的双内参基因。
2.4.4 不同样品中两内参基因表达稳定性分析
进一步选用两株生丝微菌FJNU6和FJNUY菌株分别以gapdh和recA作为内参基因，在4个不同发酵时间点的表达稳定性进行检测和验证。如图7所示，gapdh和recA扩增的Ct值都在23～27，显示出较高的表达水平。SPSS单因素方差分析统计结果为：gapdh基因的P值（Pvalue ）为0.79>0.05，recA基因的P值为0.28>0.05。说明这两个内参基因在不同发酵时间点和不同菌株之间的表达稳定。因此，gapdh和recA可以作生丝微菌的双内参基因。
3 讨论与结论
实时荧光定量PCR（RTqPCR）是对常规 PCR技术的进一步补充和发展，可以准确地分析基因在不同时期的表达差异性，已经成为分子生物学中研究基因表达的主要方法[23-24]。理想的内参基因的表达稳定性可以根据试验条件而不同，不同的环境条件下，内参基因的表达水平可能存在差异[25-26]。目前，关于内参基因的筛选，许多都是通过分析和评估单个基因的稳定性[27-29]，单个内参基因的应用可能会导致试验结果的准确性差等风险。所以对于内参基因的筛选，为了达到最好的效果，需要考虑候选基因的稳定性和重复性，还要考虑内参基因的个数[30]。
研究表明，pqq合成基因的表达差异与PQQ产量有着直接关系[31]，低pH和有限的氧气环境也会影响pqq合成基因的表达[32]，因此对pqq合成基因的表达研究对提高PQQ产量是很有必要的。我们通过查阅文献并结合FJNUR6全基因组分析，选取了16S、gapdh、recA、ldh、rpoB、S5这6个基因作为候选内参基因。16S在大部分细菌中其序列都是保守的，常被用作内参基因，但是，16S在生丝微菌中的Ct值在6～8，表达量过高，不适合做生丝微菌的内参基因。虽然NormFinder分析结果表明6个候选内参基因都可以用作生丝微菌的内参基因使用，但是结合Bestkeeper和geNorm软件的评估，gapdh和recA在样品中稳定性好，适合用于多个内参的选择。Gapdh是作为糖酵解过程中的关键酶，recA是参与DNA修复的recA蛋白的编码基因，两者与生物的生命活动息息相关，且表达相对稳定，常用作内参基因[33]。
由三款软件分析并确定最终的内参基因为gapdh和recA，并进一步在两株生丝微菌中验证，这两个内参基因在不同发酵时间点和不同发酵菌株中均稳定表达，可作为生丝微菌的内参基因。
利用Bestkeeper、geNorm和NormFinder 软件的评估和分析，最终确定了gapdh和recA基因作为生丝微菌FJNU6实时荧光定量PCR的双内参基因，同时使用两个内参基因使试验结果更加精确，这一研究结果为后续生丝微菌PQQ合成基因调控试验提供了理论基础。
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（责任编辑：林玲娜）
收稿日期：2019-11-02
作者简介：刘孟粟，男，1993年生，硕士研究生，主要从事微生物代谢工程调控研究。
共同第一作者：钟璐芳，女，1992年生，硕士研究生，主要从事微生物生理生化研究。
通信作者：黄建忠，男，1966年生，教授，主要从事微生物功能基因和工业酶制剂的研发工作（Email：hjz@fjnu.edu.cn）。
基金項目：国家自然科学基金项目 （21807011）;福建省自然科学基金项目 （2018J01673）;福建省省属高校科研专项（JK2017012）。
