新酵母底盘在摇瓶中生产529.0mg/LPPD，10L分批发酵中生产11.02g/L。基于这种高PPD生产的底盘，我们建立了一系列的细胞工厂来生产人参皂苷Rh2。作者选择了它作为新的底盘菌株，增加了UGTPg45的拷贝数，并设计了其启动子来增加表达水平。此外，还从其他植物物种和源自UGTPG45直接进化的突变体中筛选出了更高效、更兼容的UGT生物突变体。结合所有的工程策略，作者建立了一个迄今为止报道的生产最多的人参皂苷Rh2的酵母细胞工厂，摇瓶生产179.3mg/L，10L补料分批发酵生产2.25g/L。研究结果为改进酵母细胞工厂生产植物稀有天然产物，特别是糖基化产物树立了一个成功的例子。
02. 全文速览
在本研究中，我们通过过表达所有甲羟戊酸(MVA)通路的基因，优化表达细胞色素P450酶在酵母中，提高葡萄糖向PPD的转化。此外，我们采用几种策略来优化细胞工厂生产人参皂苷Rh2通过提高UGTPg45表达水平和活动，包括：（1）增加UGTPg45表达通过增加其拷贝数和工程启动子和（2）通过蛋白质工程基于体内定向进化和从其他植物物种寻找具有更高C3-OH糖基化效率的UGTs，增加在酵母中体内活动的UGTPg45。
结合所有的工程策略，作者建立了一个迄今为止报道的生产最多的人参皂苷Rh2的酵母细胞工厂，摇瓶生产179.3mg/L，10L补料分批发酵生产2.25g/L。研究结果为改进酵母细胞工厂生产植物稀有天然产物，特别是糖基化产物树立了一个成功的例子。
03. 研究背景
人参皂苷Rh2来源于人参，是一种很有前途的癌症预防和治疗的候选药物。而人参皂苷Rh2占人参干根的比例不到0.01%。目前市售的人参皂苷Rh2主要是通过从人参中分离出的主要原人参二醇(PPD)型人参皂苷使用化学或生物转化的方法去糖基化而产生的。然而，这种方法严重依赖于人参的栽培。连续种植人参是不可持续的，导致生产力低，易受疾病爆发的影响。一种合成生物学策略有望在代谢工程微生物细胞工厂中从葡萄糖中人工生产人参皂苷Rh2。PPD是所有达玛烷型人参皂苷的共同前体，包括人参皂苷Rh2。需要一种糖基化PPD产生人参皂苷Rh2的关键酶。此外，优化PPD生产底盘也可以提高人参皂苷Rh2的产量。
04. 图文导读
图1是本文的工程酵母中人参皂苷Rh2的生物合成途径示意图。蓝色基因形成上游模块，红色基因形成下游模块，绿色基因是udp-糖基转移酶生物体。将2,3-氧化角鲨烯转化为PPD，即PgDDS、CYP716A47和PgCPR1，也是PPD生物合成所必需的。
因此，我们的目的是过表达这13个基因。这13个基因被分为两组。第一组被称为上游模块，包括7个上游基因(ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI和tHMG1)，将乙酰辅酶A转化为类异戊二烯构建块异戊烯基磷酸(IPP)和二甲基烯丙基磷酸(DMAPP)。第二组为下游模块，包含剩下的6个下游基因(ERG1、ERG20、ERG9、synPgDDS、synPgPPDS和synPgCPR1)，将IPP和DMAPP转化为目标产物PPD。将三个异源基因PgDDS、CYP716A47和PgCPR1在酵母中表达密码子优化，分别命名为synPgDDS、synPgPPDS和synPgCPR1。
将下游模块整合到酵母菌株BY4742的deltaDNA位点后，所得菌株ZW03BY在摇瓶中从葡萄糖中得到2.7mg/LDM和237.9mg/LPPD。（图2）将上游模块整合到ZW03BY的Yprc-delta15位点，得到菌株ZW04BY，在摇瓶中，其PPD滴度进一步提高至329.7mg/L。
为了进一步提高DM向PPD的转化率，将另一个synPgPPDS副本引入ZW04BY的rDNA位点，构建菌株ZW04BY-RS，在摇瓶中PPD产量达到529.0mg/L，是菌株ZW03BY的两倍以上。这表明作者的设计应该是可行的，因为与ZW-PPD-b相比，只需要单整合就可以使PPD滴度提高3倍以上。
为了评估新PPD底盘的人参皂苷Rh2生物合成效率，将强组成型启动子TDH3控制下的UGTPg45引入ZW04BY-RS22,23的单拷贝X-4位点。而所得菌株ZWDRH2-1在摇瓶中仅产生了35.7mg/L的人参皂苷Rh2（图3）。因此，有必要提高糖基转移酶的表达水平或活性。
首先，我们试图通过将UGTPg45的多拷贝引入deltaDNA位点来增加UGTPg45的表达，该位点在酵母染色体上有数百个拷贝。所得菌株ZWDRH2-2的人参皂苷Rh2产率提高到52.7mg/L。接下来，我们引进了由Blazeck等人构建的强人工启动子UASTEF1-UASCIT1-UASCLB2-TDH3(以下简称UAS-TDH)。取代TDH3启动子24，得到菌株ZWDRH2-3。结果表明，人参皂苷Rh2的产率进一步提高到74.7mg/L（图3）。
为了比较其人参皂苷Rh2的合成效率，将编码基因UGT73F3、UGT73C10和UGTPn50导入ppd产生底盘ZW04BYRS的X-4位点，分别构建菌株ZWDRH2-4、ZWDRH2-5和ZWDRH2-6。ZWDRH2-5和ZWDRH2-6分别产生了人参皂苷Rh2的14.1mg/L和45.6mg/L（图4a）。
结果表明，UGTPn50的引入使人参皂苷Rh2的产量高于UGTPg45，从而使产量增加了27.7%。随后，利用强启动子UAS-TDH3将UGTPn50整合到ZW04BY-RS的多拷贝deltaDNA位点，得到菌株ZWDRH2-7。ZWDRH2-7在摇瓶中，ZWDRH2-7的人参皂苷Rh2产率为145.7mg/L，是ZWDRH2-3的2倍。
图5显示了不同UGT突变体在PPD底盘菌株中生产人参皂苷Rh2。三个突变体分别整合到ZW04BYRS的染色体中。所得到的菌株ZWDRH2-6A、ZWDRH2-6B和ZWDRH2-6C分别产生了45.5mg/L、55.6mg/L的人参皂苷Rh2和80.0mg/L（图5）。
在UAS-TDH3启动子的控制下，通过将UGTPn50-HV整合到deltaDNA位点，构建了最终的Rh2细胞工厂ZWDRH2-10。ZWDRH2-10在摇瓶中的Rh2产量达到179.3mg/L，是菌株ZWDRH2-1的5倍。
在UAS-TDH3启动子的控制下，通过将UGTPn50-HV整合到deltaDNA位点，构建了最终的Rh2细胞工厂ZWDRH2-10。
ZWDRH2-10在摇瓶中的Rh2产量达到179.3mg/L，是菌株ZWDRH2-1的5倍（表2）。据我们所知，这是有史以来在摇瓶系统中最高的Rh2产量。
我们首先在一个10L的生物反应器中对PPD生产的底盘ZW04BY-RS进行了补料分批发酵。发酵时间在144h内完成，最大生物量达到143.0g/L干细胞重量(dcw)。最终的DM和PPD滴度分别达到7.1g/L和11.02g/L（表3），这是迄今为止报道的最高的PPD产量。
其次，人参皂苷Rh2细胞工厂菌株ZWDRH2-10的补料分批发酵，发酵参数与ZW04BY-RS相同。144h内完成，最终生物量为157.3g/Ldcw。最终的DM、PPD和人参皂苷Rh2滴度分别为8.10、9.05和2.25g/L（表3）。这是人参皂苷Rh2的最高产量和首次克级产量报告。
05. 总结与展望
我们构建了产生PPD的底盘应变ZW04BY-RS，该菌株在摇瓶系统中PPD滴度为529.0mg/L，在10L生物反应器中PPD滴度为11.02g/L（表2和表3）。基于此菌株，我们开发了一个人参皂苷Rh2细胞工厂ZWDRH2-10，人参皂苷Rh2滴度为179.3mg/L，在10L生物反应器中为2.25g/L。据我们所知，这不仅是工程微生物中人参皂苷Rh2的最高产量，而且是经过糖基化修饰的天然产物的最高产量。我们认为，与传统人参提取相比，ZWDRH2-10发酵的人参皂苷Rh2的克级产量可以大大降低Rh2的生产成本。然而，在商业生产之前，有必要在较大的发酵罐中进行试点工厂试验。
