河南农业大学生命科学学院的研究人员在International Journal of Biological Macromolecules上发表题目为《Evolution of plasmid-construction》的文章，将从进化的角度对37种质粒构建方法进行介绍，主要通过创建单链 突出端、重组同源臂和以扩增插入片段作为超级引物的3大原则，分为单链突出端克隆、同源重组克隆和Mega-Primer克隆三类（图1）。第一类包括II型酶克隆、LIC、In-Fusion、Gibson 组装、UDG-based LIC、TOPO、EFC等。第二类包括ET克隆、Gateway cloning、SLiCE((Seamless Ligation Cloning Extract)。第三类包括PCR-LFC、Insertion PCR 、IFPC(Inverse Fusion PCR Cloning)、Stepreverse-PCR、Intra-Molecular Homologous Recombination等[1]。
图1箭头表示三类质粒构建方法及进化路线
一、单链突出端克隆
1.1II型酶克隆
II型酶克隆要求插入片段和载体具有两个不同的兼容限制性内切位点进行定向克隆[2]。被内切酶切成互补的突出端ssDNA，插入和载体通过DNA连接酶(通常是T4 DNA连接酶)连接成环状质粒(图2左)。虽然这项技术被广泛应用，但仍存在许多缺点：1）DNA消化效率低下，限制性内切酶的活性不一致。2）DNA连接需在37°C下进行3小时或12-16°C下进行过夜。3）插入段长度应小于20kb。 具有非模板互补的3 ' A突出端，将通过TA 克隆将Taq扩增的PCR产物直接连接到含有3 '-T突出端的线性载体中，而它仅限于taq扩增的PCR产物。研究表明结合的Taq-DNA聚合酶将会干扰连接效率，但蛋白酶K可以降低这种干扰。不过蛋白质表达的成功率低将是一个致命的缺点。
1.2LIC
作为II型酶的替代品，T4 DNA聚合酶具有特定的dNP可控3'外切核酸酶活性。插入片段和载体被扩增以具有约束重叠，被T4DNA聚合酶消化为5'-ss突出端DNA，并退火成环状质粒。质粒的间隙、突起和划痕在转化后由宿主细胞修复（图2左）。而在SLIC(SequenceIigation Independent Cloning)中，约束重叠通过dCTP阻断和重组酶RecA得以释放[3]，One-step SLIC 更是通过一次T4 DNA聚合酶反应释放dCTP阻断。综上所述，LIC从约束重叠，dCTP阻断发展到一步T4 DNA聚合酶反应，T4 DNA聚合酶的酶切时间和酶切量应与重叠长度有关。该技术已用于高通量晶体学的550多种人类蛋白质。
1.3In-Fusion
将插入片段和载体扩增至有重叠，通过人痘病毒DNA聚合酶消化成5′-ss突出端DNA，并退火成相对稳定的质粒。在Mg2+和低浓度的dNTPs作用下，DNA聚合酶会结合质粒的缺口或缝隙。通过位点特异性重组克隆策略，验证了该重组方法，并利用牛痘病毒DNA聚合酶克隆了水疱性口炎新毒株的全长cDNA。
1.4Gibson组装
该技术利用T5 DNA外切酶制造3′-ss突出端DNA，并用DNA聚合酶填补空隙，TaqDNA连接酶进行连接，可组装大至300-583kb的重叠DNA，使基因重组成的误差低于1/50 DNA分子。而在 Hot Fusion 中，由于无需 Taq DNA 连接酶连接，无需进行载体纯化。T5 核酸外切酶 DNA 组装（TEDA，T5 exonuclease DNA assembly）仅应用 T5 DNA 核酸外切酶反应。如今Gibson 组装从具有17-30bp重叠的DNA的三个酶反应发展到具有9-20bp重叠的DNA的一个酶反应。该技术已用于生殖支原体582,970bp基因组的化学合成、组装和克隆。
1.5UDG-based LIC
插入片段和载体通过具有尿苷（U）而不是胸苷（T）的PCR进行扩增后具有重叠。重叠部分被UDG消化为ss突出端DNA，通过T4核酸内切酶V延长，以断裂碱性位点3 '末端的磷酸二酯骨架，同时互补的ss突出端，插入片段和载体在载体中进行结合。该技术需要高成本、低保真度的DNA聚合酶和U（T）的插入。
1.6TOPO克隆
由含有CCCTT突出端的载体激活，拓扑异构酶I在37 ℃下克隆含有CCCTT突出端的插入片段5分钟。TOPO TA载体和TOPO平端载体都可以用作通用载体来克隆具有A端、平端或粘性末端的DNA[4]。
1.7EFC
两组相同的无尾和加尾的PCR用于扩增两种DNA分子（图2右）。其中一种PCR使用带尾正向和无尾反向PCR，另一种PCR使用无尾正向和带尾反向PCR。两种PCR扩增产物分别通过变性再退火过程重新退火为Z型突出端DNA（图2右，虚线框）。自组装克隆（SAC，Self-assembly cloning）为DpnI提供消化模板，T型无酶克隆（TEFC，T-type enzyme-free cloning)将两种PCR扩增产物分别重新退火为T型突出端DNA(图2右，硬线框)，具有相容的ss突出端，插入片段和载体与缺口质粒结合。T型DNA可产生80CFU/ng的转化子，阳性率是Z型DNA的10倍。而该技术需要8个PCR、DpnI消化以及分别杂交到Z型或T型悬垂DNA中。
聚合酶不完全引物延伸法（PIPE，Polymerase incomplete primer extension）将Taq扩增的插入片段和载体直接退火到环状质粒中，质粒的缺口在转化后可被宿主细胞修复。该技术已用于高通量448个蛋白的克隆和2143个蛋白的截断。
图2 利用II型酶、T4 DNA聚合酶、
人痘病毒DNA聚合酶、牛痘病毒DNA聚合酶(左)
或PCR(右)等酶进行单链突出端克隆
二、同源重组克隆
2.1ET克隆
ET克隆用于含有RecE588Tγ的特殊大肠杆菌GB05细胞的体内同源重组，具有5 '外切酶的活性。RecT具有ss dna结合活性，而Redγ保护线性DNA免受降解。用10%阿拉伯糖诱导表达RecE588Tγ蛋白后，大肠杆菌GB05细胞被制成受感细胞，并通过具有30-60bp同源臂的插入片段和载体共电孔进行体内重组(图3左)，循环-线性重组的效率高于线性-线性重组，前者在100bp的同源臂处达到平台期，而后者在1.5kb时才达到。
在克隆RecETγ时，整个RecE的线性重组效率提高了20倍。使用T4 DNA聚合酶和RecA进行ExoCET(外切酶结合RecET重组)可进一步提高RecETγ效率。tExo克隆用于RecE的c端341个氨基酸突变体进行体外重组。ET克隆从RecE588Tγ、RecETγ发展到与T4DNA聚合酶和RecA结合，已被用于克隆大至52-106kb的dna和鉴定次生代谢物。
2.2Gateway克隆
用于体外同源重组的λ噬菌体位点特异性重组系统包括attP、attB、attL和attR位点[5]，每个位点具有特定的7bp核心序列，以实现最小的交叉反应性。BP克隆酶(λ噬菌体整合酶和整合宿主因子)在attP和attB位点重组插入片段和供体载体，构建进入克隆(图3右)。LR克隆酶(BP克隆酶加噬菌体切除酶)在attL和attR位点将进入克隆与目的载体重组以构建质粒。由于attB1的25bp位点以胸腺嘧啶(T)结尾，因此基因特异性引物不应以AA、AG或GA开头，以避免蛋白的预终止表达。作为高通量克隆方法，Gateway 克隆已被用于从人类、酿酒酵母和铜绿假单胞菌中创建了13000个母系克隆。
图3 同源重组克隆
2.3SLiCE
该技术通过使用PPY细胞(与λ噬菌体重组酶Redα整合的RecA-大肠杆菌)的提取物进行体外重组，一个或多个插入可以在37℃中分批或多次克隆1小时。从大肠杆菌JM109、DH5α、XL10-Gold和Mach1T1等其他细胞中提取，总转化子数为4604 CFU/ng，阳性率99%。另外Exnase 克隆使用未知的 Exnase II重组酶，在 37°C 下对具有 20-40 bp 同源臂的插入片段和载体进行体外重组 30 分钟，其转化子为5.7-13.5 CFU/ng，阳性率为30 - 80%。
三、Mega-Primer克隆
3.1随着线性载体的线性扩增
PCR-LFC从Mega-Primer克隆开始，插入片段被扩增在线性载体的两端重叠，并在第一个循环中作为正向或反向的Mega-Primer与线性载体一起延伸到线性质粒中，在随后的第二次PCR的2-15个循环中分别扩增两个线性质粒(图4左)。一步法无连接酶克隆PCR(SLFC，Single-Step Ligase-Free Cloning PCR)采用PCR脱自然再退火工艺。反共振峰为~5-10CFU/ng。然而，该技术需要4个引物进行2个平行的PCR扩增，并通过引物消除再退火成环状质粒。
Quick Assemble 以及环型聚合酶延伸克隆技术（CPEC，Circular Polymerase Extension Cloning) 通过将Mega-Primer同时退火到线性载体的两端来扩增环状质粒[6]。而Quick Assemble扩增的是线性质粒而不是环状质粒，其中6.4 kb的PCR产物等于1.7 kb的插入片段加上4.7 kb的载体，由于线性质粒的转化，其效率比完整质粒低105倍。
延长重叠延伸PCR（POEP，Prolonged Overlap Extension PCR)可扩增多个质粒。扩增到有重叠时，插入片段和载体在第一个循环中相互延伸成线性质粒，在第二个PCR的2-25个循环中，线性质粒相互延伸成多聚体。将多聚体直接转化到受感细胞中，在转化后循环成单体质粒。然而，预期的质粒被伪装成更高分子的产物，比完整质粒低105倍的效率可归因于线性多聚体的转化。
3.2线性扩增与环状载体
将插入片段扩增至与环状载体重叠，长度为20-40 bp（图4中），插入片段可与环状载体协同进行“超级引物”扩增，从而在Insertion PCR和Integration PCR中扩增质粒。根据基因突变，MEGAWHOP将这种技术称为“超级引物合成技术”，用于扩增整个质粒。无限制克隆（RFC，Restriction Free Cloning）分析表明，最大的插入载体为15 kb 。通过优化重叠延伸PCR，可在17-18个循环中实现最佳扩增。DNA克隆转移PCR（TPCR，Transfer-PCR for DNA Cloning）将插入片段扩增和质粒扩增结合在一起。
该技术旨在扩增环状缺口质粒，超级引物的大小限制在6.7kb以下。两个超级引物在载体上短暂重叠，但彼此完全不重叠。严格的PCR要求高保真DNA聚合酶、高质量超级引物和高浓度模板。
3.3指数扩增
将插入序列扩增至与下游插入位点的向量重叠20-25个碱基（如图4右），插入序列可通过与EMP（Exponential Megapriming PCR）中的载体特异性引物结合，使质粒呈指数级扩增。Step reverse-PCR将该技术称为分子内平末端连接。IFPC使用提供的引物扩增质粒，在对模板进行DpnI消化后，线性质粒被纯化，并用T4 DNA连接酶连接后再转入有能力的细胞中。
转化子在EMP中的数量是RFC的5倍以上，仅需0.5 ng载体即可进行指数级扩增质粒。而线性质粒DNA需要与环状质粒进行连接，插入和载体的引物应具有相似的退火温度，通过双退火温度PCR策略可以克服这一需求。
图 4 线性载体(左)、环状载体(中)和
指数扩增(右)线性扩增的Mega-Primer克隆
四、质粒构建机制及发展
质粒构建从生成ssDNA突出端开始，并通过退火或引物延伸与载体一起完成。因此，质粒构建机制是引物退火或引物入侵，分别用于ssDNA突出端或同源重组克隆。与引物退火不同，引物入侵需要在模板上进行DNA延伸。ET克隆是从环状-线性重组发展而来的，分别用于引物入侵或引物退火。Mega-Primer克隆是从线性克隆发展到环状-线性克隆，分别用于线性或环状载体。通过重组酶产生双链断裂，寻找同源臂ssDNA突出端，并将它们退火在一起。综上，ssDNA突出端克隆是从II型限制性内切酶、DNA外切酶到PCR的发展过程；同源重组克隆是从体内到体外重组的发展过程；Mega-Primer克隆是从线性扩增与线性载体、环状载体到指数放大的发展过程，质粒构建沿着容易、高效或无缝克隆的路线发展。
而质粒构建从疤痕克隆发展到无缝克隆。疤痕克隆指的是核苷酸不可避免的插入，而无缝克隆指的是插入-载体连接处的随机插入或突变。在无缝克隆中，ET克隆的准确质粒率最高，因此插入片段和载体的重叠长度越长，在体内连接到准确的质粒的可能性越大。最近，许多软件和平台被开发出来，用于简化质粒构建，例如SnapGene查看器、ApE（质粒编辑器）、Plasma DNA、Plasmidomics、pLOT和BVTech质粒等。这些软件和平台可以轻松地显示限制位点、启动子、RBS（核糖体结合位点）、起始密码子、终止密码子、终止子、6×His等信息。
五、疤痕连接问题
质粒构建技术已经取得了巨大的进步。然而，疤痕连接(插入缺失或插入载体连接处突变)质粒仍偶尔发生。虽然我们可以从不同的转化子中筛选出准确的质粒，但疤痕接合点仍然是一个必须面对的科学问题。如果疤痕接合点总是出现，我们必须不时更换不同的载体。疤痕接合点会导致插入载体和合成基因组的框架移位和无义突变[7]。其中一个原因是不完整的PCR产物，这可以通过高保真DNA聚合酶，如Phusion或Q5DNA聚合酶来解决。另一种是通过连接依赖克隆构建的缺口环状质粒，称为无缝克隆（如LIC、EFC、InFusion、Overlap extension PCR和mega-primer cloning），如短的ssDNA突出端经退火后更容易被宿主细胞修饰，从而与疤痕质粒连接。
同时依赖连接的克隆技术还可以构建出带有粘性末端的环状质粒，例如使用II型酶的克隆技术、TA克隆、IFPC、EMP、逆转录PCR以及分子内克隆同源重组。综上，构建完整的质粒可以避免宿主细胞的缺口修饰。这需要更长的ssDNA突出端部分，以容纳至少两个DNA连接酶分子。
结语
本文主要讨论了质粒构建的演变过程，质粒构建的不同方法和技术的发展，包括单链突出克隆、同源重组克隆和Mega-Primer克隆。同时还介绍了从有疤痕克隆到无缝克隆的演变过程。此外，文章还提到了一些软件和平台，用于辅助质粒构建。
其中37种构建质粒的方法和技术。这些方法主要依赖于DNA酶，如II型限制酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、UDG和TOPO克隆。此外，同源重组和PCR也应用于质粒构建中。这些方法中的一些已经演变成了新的版本，如LIC、EFC、Gibson组装、ET克隆、PCR-LFC、分子内同源重组等。作者对37种构建质粒的方法进行了分类，分析了构建质粒的机制，并提出了在构建质粒过程中仍存在的问题，为质粒构建提供清晰简单的实践方法和明确的发展方向。
