亚精胺(spermidine)是一种具有强烈生物活性的低分子脂肪族含氮碱[1],作为多胺的一种，广泛分布于生物体内，参与细胞的增殖、生长、组织再生、DNA和RNA的稳定等过程，在细胞代谢中起重要作用[2-5]。随着人们对亚精胺的逐步研究，发现亚精胺在机体健康和疾病方面具有重要功能，具有诱导细胞自噬、延缓衰老、提高记忆力、保护心血管、预防癌症等多种生物活性[6-9]。有研究表明，随着年龄的增长，人体内亚精胺浓度逐渐降低，这可能会影响人体的健康与寿命[10-13]。而通过外源摄入适量亚精胺来实现人体内亚精胺浓度的平衡，可能是促进健康、延缓衰老的有效策略[14-15]。

目前已报道多种微生物具有合成亚精胺的能力[16-19]。在微生物体内亚精胺可由腐胺(putrescine)和S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)合成，腐胺在亚精胺合成酶(spermidine synthase)作用下接受S-腺苷甲硫氨酸脱羧提供的氨丙基生成亚精胺[20-22]。KIM等[23]通过在酿酒酵母中强化表达鸟氨酸脱羧酶SPE1，S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶SPE2和亚精胺合成酶SPE3，同时敲除了鸟氨酸脱羧酶的抑制基因OAZ1，亚精胺的产量达到了63.6 mg/L。随后研究发现,进一步敲除多胺转运蛋白TPO1，亚精胺的产量进一步提升，最终通过发酵放大产量达到了224 mg/L[24]。也有研究者通过在集胞藻中强化表达精氨酸脱羧酶Adc1和Adc2基因，提高了细胞内亚精胺产量[25]。然而，目前的亚精胺产量普遍偏低，亚精胺合成机制和代谢工程育种还有待进一步发展。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有安全性良好、生长快、易于培养等特点，广泛应用于食品、医药、化妆品和农业领域[26-27]。随着芽胞杆菌遗传背景和分子操作工具的不断完善和发展，芽胞杆菌已发展成为新的代谢工程底盘微生物，目前已逐渐被用来生产各种营养强化剂和食品添加剂[28-29]，但目前尚未有通过解淀粉芽胞杆菌合成亚精胺的相关报道。KEGG数据库已预测解淀粉芽胞杆菌含有亚精胺合成途径相关基因：speE基因编码亚精胺合成酶，腐胺和S-腺苷甲硫氨酸在亚精胺合成酶催化下生成亚精胺。speE基因处于至关重要的位置，是合成亚精胺的关键，然而其功能尚未通过实验验证。本研究通过基因缺失和回补表达技术，从体内水平探究speE基因对亚精胺合成的影响，首次证实了speE基因在解淀粉芽胞杆菌亚精胺合成中的功能，为后续构建亚精胺高产工程菌株提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

本研究所用到的菌株和质粒如表1和2所示。其中大肠杆菌DH5α用于构建载体，HSPM1为本实验室保存的1株高产SAM的工程菌株。

表1 实验用菌株

Table 1 Strains used in the experiment

表2 实验用质粒

Table 2 Plasmids used in the experiment

注：Tetr：四环素抗性；Kanr：卡那霉素抗性；orits：温敏型复制子

1.1.2 PCR引物

本研究所用的主要引物见表3。

1.1.3 主要试剂

TransStartR FastPfu DNA聚合酶和 TransStartR easyTaq DNA聚合酶,北京全式金公司；dNTPS、DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DL5000 Marker,TaKaRa公司；DNA抽提试剂盒,武汉楚诚正茂科技工程有限公司；DNA回收试剂盒和质粒抽提试剂盒,美国OmegaBio-Tek公司；基因引物合成、测序,武汉擎科创新生物科技有限公司；乙腈为色谱级，其他主要生化试剂均为国产分析级纯。

表3 本研究所使用的PCR引物

Table 3 Primers used for PCR in this study

注：粗体为限制性内切酶酶切位点，下划线为重叠延伸拼接SOE-PCR的重叠区域

1.1.4 主要培养基

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸出粉5.0，NaCl 10.0，固体培养基加15～20 g/L的琼脂粉。抗生素培养基添加相应抗生素终质量浓度为20 μg/L。亚精胺发酵培养基(g/L)：木糖20.0，(NH4)2SO4 6.3，蛋白胨10.0，玉米浆20，NaCl 2.5，KH2PO4 3.0，MgSO4·7H2O 4.2，尿素2.0，天冬氨酸3.0，pH 6.5。

1.1.5 仪器与设备

Thermal Cycler(My Cycler)PCR仪，美国 Bio-Rad 公司；DYY-8C型电泳仪，北京六一仪器厂；HQL300B恒温大幅振荡摇床，武汉中科科仪技术发展有限责任公司；CR21G高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；Legend Micro17R高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific 公司；SKP-02.420电热恒温培养箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司；Agilent Technologies1260高效液相色谱，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 敲除载体的构建

以B.amyloliquefaciens HZ-12的基因组DNA作为模板，利用上游同源臂引物(ΔspeE-AF,ΔspeE-AR)和下游同源臂引物(ΔspeE-BF，ΔspeE-BR)分别扩增出同源臂序列A和B，产物纯化回收后通过SOE-PCR用引物ΔspeE-AF，ΔspeE-BR将A和B连接起来，并与T2(2)-ori载体同时用限制性内切酶BamH I和Xba I进行双酶切，回收后用T4 DNA连接酶连接，采用CaCl2转化法转化到E.coli DH5α感受态细胞。钙转化成功后提取质粒进行双酶切验证并送往测序公司测序，构建成功的敲除质粒命名为T2(2)-oriΔspeE。

1.2.2 基因敲除菌株的构建

将构建成功的质粒电转化入HSPM1感受态细胞中，涂布至含Kan的抗性平板，37 ℃静置培养16～18 h。挑选转化子单菌落于Kan平板上划线，培养8～12 h后用进行PCR菌落验证(引物T2-F,T2-R)。将电转正确的菌株45 ℃下进行单交换，ΔspeE-YF引物和T2引物验证；获得的单交换菌株在37 ℃下双交换，挑选在LB板上长而在Kan抗性板上不长的单菌落，用ΔspeE-YF和ΔspeE-YF验证，筛选到敲除菌株，命名为HSPM1ΔspeE。

1.2.3 游离表达载体的构建

以分别以B.subtillis 168基因组、B.amyloliquefaciens HZ-12基因组和B.licheniformis WX-02基因组，根据表3相对应的引物，扩增出P43启动子、speE基因、终止子TamyL。纯化回收PCR产物，以P43-F、TamyL-R为引物通过SOE-PCR连接起来，与pHY300PLK质粒分别用BamH I和Xba I进行双酶切，用T4连接酶连接PCR产物和质粒，并转化至E.coli DH5α感受态细胞。用pHY300-F和pHY300-R对单菌落进行PCR验证，初步确定为阳性转化子后，抽取质粒进行双酶切和DNA测序验证，构建成功的游离表达载体命名为pHYspeE。

1.2.4 基因回补菌株的构建

将抽提的pHYspeE和空载体pHY300PLK电转化至HSPM1ΔspeE感受态中，涂布于Tet抗性平板，37 ℃静置培养。挑选转化子单菌落于Tet平板上划线，用pHY300-F、pHY300-R进行PCR菌落验证。

1.2.5 发酵培养条件

从活化的平板上挑取单菌落接种于50 mL液体LB中，37 ℃，180 r/min下培养9 h，携带质粒的菌株培养基需加入相应的抗生素，培养12 h左右。以3%(v/v)的接种量接种于25 mL的发酵培养基中，37 ℃，180 r/min，培养60 h。

1.2.6 亚精胺液相检测

取0.5 mL发酵液与1.5 mL 0.4 mol/L的高氯酸，混合酸提1 h，(12 000 r/min下离心5 min。吸取250 μL上清液，并依次加入100 μL(1 mg/mL)1, 7-二氨基庚烷，75 μL饱和NaHCO3溶液，50 μL 2 mol/L NaOH溶液以及500 μL(5 mg/mL丙酮)丹磺酰氯衍生剂，上下颠倒混匀。50 ℃水浴，避光反应45 min。再加入25 μL体积分数25% NH3·H2O并上下颠倒混匀，继续放于50 ℃水浴中，避光静置15 min。最后加入30 μL 6 mol/L HCl和575 μL乙腈，10 000 r/min离心5 min，取800 μL上清液0.22 μm有机膜过膜进行测定。

液相检测使用ZORBAX Eclipse XDB-C18 色谱柱，流动相采用超纯水和乙腈进行梯度洗脱，流速1 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

1.2.7 数据统计分析

每组实验设计3个平行，采用SPSS 20.0进行数据统计分析，Origin 8.5进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 speE基因缺失菌的构建及其对亚精胺合成的影响

2.1.1 speE基因缺失菌的构建

根据表3中引物获得T2(2)-oriΔspeE敲除质粒的上下游同源臂，分别为546、520 bp，其中speE基因和其启动子一同设计为被敲掉部分，SOE-PCR产物大小为1 066 bp。SOE-PCR融合产物与T2(2)-ori载体分别用BamHⅠ和XbaⅠ进行酶切、酶连后钙转化至E.coli DH5α感受态细胞。PCR验证显示条带正确的单菌落，抽提质粒测序并用BamHⅠ和XbaⅠ酶切质粒，电泳检测结果如图1-a所示，质粒双酶切的跑胶条带大小与预期相符合，测序结果显示正确，表明敲除质粒T2(2)-oriΔspeE构建成功。

将敲除质粒T2(2)-oriΔspeE电转化至HSPM1感受态细胞中，经过单双交换筛选敲除菌株。抽提正确敲除菌株和未敲除菌株DNA，以speE-YF/speE-YR为引物，扩增的片段分别是1 291和2 232 bp，电泳检测结果如图1-b。将PCR扩增产物送往测序公司测序，比对结果正确，表明HSPM1敲除speE基因菌株构建成功，命名为HSPM1ΔspeE。

a-重组质粒T2(2)-oriΔspeE的双酶切验证; b- HSPM1ΔspeE菌株的PCR验证;泳道 1：speE基因上下同源臂SOE-PCR融合片段;泳道 2：BamHⅠ和XbaⅠ双酶切质粒T2(2)-ori;泳道 3：BamHⅠ和XbaⅠ双酶切质粒T2(2)-oriΔspeE;泳道 4:引物ΔspeE-YF和ΔspeE-YR验证HSPM1(2 232 bp);泳道 5:引物ΔspeE-YF和ΔspeE-YR验证HSPM1ΔspeE(1 291 bp)

图1 敲除speE基因的电泳图

Fig.1 Electrophoretogram of knockout speE gene

2.1.2 speE基因缺失对亚精胺合成的影响

speE基因编码亚精胺合成酶，腐胺和S-腺苷甲硫氨酸在亚精胺合成酶催化下生成亚精胺。为了考察speE基因对亚精胺合成的影响，按照材料与方法中1.1.5和1.2.5的发酵培养基和培养条件对工程菌株HSPM1ΔspeE进行发酵验证，发酵周期60 h。用分光光度计测生物量OD600，HPLC检测亚精胺含量。结果如图2所示。

图2 speE基因缺失对亚精胺合成的影响

Fig.2 The effect of speE knockout on spermidine synthesis

从发酵验证图上看出，HSPM1与HSPM1ΔspeE的生物量OD600无显著差别。对照菌株HSPM1亚精胺产量为36.6 mg/L，而工程菌株HSPM1ΔspeE，未检测到亚精胺。在细菌的生长未受太大影响的情况下，工程菌株HSPM1ΔspeE未检测到亚精胺，说明敲除speE基因后阻断了亚精胺的合成，亚精胺的缺失是由speE基因引起，而不是生物量的降低。为了进一步确认亚精胺的降低是由speE基因缺失引起，构建speE基因回补菌株。

2.2 speE基因回补菌株的构建及其功能验证

2.2.1 speE基因回补表达菌株的构建

由于敲除speE基因后，完全不产亚精胺，推测亚精胺合成能力的丧失是由speE基因引起，为了证实speE基因在解淀粉芽胞杆菌中的功能，在HSPM1 ΔspeE菌株的基础上构建speE回补表达菌株，探究speE基因在解淀粉芽胞杆菌中对亚精胺合成的影响。

根据表3的引物扩增出P43启动子、speE基因、TamyL终止子大小与理论值大小一致(分别是305、831和501 bp)。SOE-PCR产物大小为1 637 bp，纯化后与pHY300PLK载体分别用BamH I和Xba I进行酶切，用T4连接酶酶连后钙转化至E.coli DH5α感受态细胞。选取验证正确的阳性转化子，抽提质粒并用BamH I和Xba I酶切质粒，电泳检测结果如图3-a，条带大小与预期符合一致，测序结果显示正确，表明pHY-speE质粒构建成功。

游离表达质粒pHY-speE电转化至HSPM1ΔspeE中，挑选阳性转化子用pHY300-F、pHY300-R进行PCR验证，验证结果如图3-b。并送往测序公司进一步验证碱基序列，比对结果无误后表明HSPM1ΔspeE/pHYspeE工程菌株构建成功。

a-重组质粒pHY-speE的双酶切验证；b-菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE的PCR验证;泳道1：speE基因、P43启动子、TamyL终止子SOE-PCR融合片段;泳道2：BamH I和Xba I双酶切质粒pHY300PLK;泳道3：BamH I和Xba I双酶切质粒pHY-speE;泳道4～5:引物pHY300F和pHY300R验证HSPM1ΔspeE/pHYspeE电泳图

图3 回补speE基因的电泳图

Fig.3 Electrophoretogram of complement speE gene

2.2.2 speE基因回补对亚精胺合成的影响

按照材料与方法中1.1.5和1.2.5的发酵培养基和培养条件对工程菌株HSPM1、HSPM1ΔspeE、HSPM1ΔspeE/pHY300、HSPM1ΔspeE/pHYspeE进行发酵验证，发酵周期60 h。发酵终点检测生物量OD600和亚精胺产量。结果如图4所示。

图4 speE基因回补对亚精胺合成的影响

Fig.4 Effect of speE complementation on spermidine synthesis

从图4看，4株工程菌的生物量OD600值无明显差别。工程菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE的发酵产量是62.32 mg/L，与对照菌HSPM1ΔspeE相比，回补speE基因后，亚精胺合成得到恢复，甚至高于未敲除speE基因的初始菌株HSPM1(33.34 mg/L)，这可能是由于游离表达质粒的拷贝数高所引起的。上述结果表明基因互补后，被阻断的亚精胺合成途径被修复，亚精胺的合成能力也得到恢复，进一步证实了speE基因是亚精胺合成途径上的关键基因，证实了speE基因在亚精胺合成中的必要性，鉴定了speE基因在解淀粉芽胞杆菌中的功能。

3 结论

亚精胺是一种具有广泛生物活性的生物胺，参与人体各类代谢反应。但是其高效生物合成却一直是广大科研工作者难以攻破的难题。本研究首次探究了解淀粉芽胞杆菌所预测的speE基因在亚精胺合成中的功能，成功构建了speE基因的缺失菌株HSPM1ΔspeE、回补菌株HSPM1ΔspeE/pHYspeE。通过发酵实验，发现缺失speE并不会影响菌株的生物量，但却显著影响亚精胺的产量，直接导致菌株不产亚精胺；回补speE基因后菌株恢复亚精胺合成能力，从体内水平证实了speE基因在亚精胺合成中的功能。本研究首次证实了speE基因在解淀粉芽胞杆菌合成亚精胺中的功能，为亚精胺高产菌株的代谢工程育种提供了重要的基因资源。

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ta-name="译文篇名" style="font-size: 1.8em; color: rgb(195, 101, 0); text-align: center; margin: 0em 0em 0.5em;">Functional identification of speE in spermidine synthesis in Bacillus amyloliquefaciens

ta-name="译文作者信息" style="font-size: 1em; text-align: center; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">MIN Yu, WEI Xuetuan*

ta-name="译文作者信息" style="font-size: 1em; text-align: center; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

ta-name="译文摘要" style="font-size: 1em; text-align: justify; text-indent: 0em; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">ta-name="译文摘要.标题" style="font-weight: bold !important;">ABSTRACT Spermidine is a natural polyamine involved in numerous biological processes, which has the functions of anti-aging, improving memory, and inducing autophagy.However, the low spermidine yield limits its development.It is crucial to excavate the genes related to spermidine synthesis for metabolic engineering breeding.The spermidine synthase gene has been predicted as speE in Bacillus amyloliquefaciens, while its function in spermidine formation has not been identified.To confirm the function of speE, a deletion mutant of speE and its complementary strain were constructed, and the impact of these gene manipulations on spermidine synthesis were analyzed.Our results indicated that the spermidine was not detectable after knocking out of speE, revealing that the deletion mutant strain was deprived of the ability to produce spermidine.After complementary expression of speE, the capacity of spermidine synthesis was recovered.In this study, the speE was first confirmed involved in spermidine synthesis in B.amyloliquefaciens, which provided the foundation for the metabolic engineering breeding of spermidine and related research.

ta-name="译文关键词" style="font-size: 1em; text-align: justify; text-indent: 0em; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">ta-name="译文关键词.标题" style="font-weight: bold !important;">Key words spermidine; Bacillus amyloliquefaciens; spermidine synthetase; gene knockout; complementary expression

ta-name="doi" style="font-size: 1em; text-align: justify; text-indent: 0em; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">ta-name="doi.标题" class="key" style="font-weight: bold !important;">DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.023126

ta-name="引文格式" style="font-size: 1em; text-align: justify; text-indent: 0em; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">ta-name="引文格式.标题" style="font-weight: bold !important;">引用格式:闵钰,魏雪团.解淀粉芽胞杆菌中speE基因在亚精胺合成中的功能鉴定[J].食品与发酵工业,2020,46(7):69-74.MIN Yu, WEI Xuetuan.Functional identification of speE in spermidine synthesis in Bacillus amyloliquefaciens[J].Food and Fermentation Industries,2020,46(7):69-74.

ta-name="作者简介" style="font-size: 1em; text-align: justify; text-indent: 0em; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">ta-name="作者简介.标题" class="key" style="font-weight: bold !important;">第一作者：硕士研究生(魏雪团副教授为通讯作者，E-mail：weixuetuan@mail.hzau.edu.cn)

ta-name="基金项目" style="font-size: 1em; text-align: justify; text-indent: 0em; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">ta-name="基金项目.标题" class="key" style="font-weight: bold !important;">基金项目：国家重点研发计划(2019YFA0906400)

ta-name="收稿日期" style="font-size: 1em; text-align: justify; text-indent: 0em; line-height: 1.8em; margin: 0.5em 0em;">ta-name="收稿日期.标题" class="key" style="font-weight: bold !important;">收稿日期：2019-12-17，改回日期：2020-01-05