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传统的角鲨烯生产方式主要是从鲨鱼肝脏或植物种子中提取，这种方法既不环保也不可持续。随着对角鲨烯需求的日益增长，寻求一种既可持续又低成本的替代生产方法变得尤为迫切。
为了寻找提高角鲨烯产量的方法，研究人员对多种菌株进行了探索。其中，酿酒葡萄球菌的效果最好，通过优化酿酒酵母（S. cerevisiae）角鲨烯生物合成途径关键基因的拷贝数，构建乙醇同化途径，在发酵 156 h 后，角鲨烯滴度达到 27.3 g/L，这是目前报道的最高滴度。然而，高浓度的乙醇对细胞生长有害，且在工业化生产中添加高浓度乙醇在成本、安全、环保等方面面临诸多挑战。
解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）作为一种非传统的酵母，对盐浓度、极端 pH 值，以及各种有机化合物具有很强的耐受性。此外，它还具有高水平的三羧酸（TCA）循环和戊糖磷酸（PP）途径，通过这两种途径可以合成大量的乙酰辅酶 A、ATP（腺苷三磷酸）和 NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）。卓越的乙酰辅酶 A 生产能力和适宜的疏水环境使解脂耶氏酵母成为生产各种天然产物的理想细胞工厂。然而，极低的染色体整合效率限制了大规模基因编辑在角鲨烯途径改造方面的潜力，即使经过代谢工程和发酵优化，其在摇瓶中的产量也仅达到 731 mg/L，难以满足工业生产的需求。
近期，来自华东理工大学的研究团队对解脂耶氏酵母进行了基因工程改造，将其同源重组（HR）靶向基因的效率提高了 68%，且未影响酵母细胞的生长。随后，他们利用具有较高同源重组靶向效率的重组菌株来有效地合成角鲨烯，并通过过表达整个甲羟戊酸（MVA）途径、增加乙酰辅酶 A 和 NADPH 的供应、削弱降解途径的方式，对解脂耶氏酵母的细胞代谢进行了系统性的重塑，从而显著提高了角鲨烯的产量。最终，在摇瓶培养和 5 L 补料分批发酵中，工程菌株的角鲨烯滴度分别达到 2.4 g/L 和 35 g/L。
▲图 | 在工程化解脂耶氏酵母中的角鲨烯生物合成途径（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
这项研究已经以“Remodeling the Homologous Recombination Mechanism of Yarrowia lipolytica for High-Level Biosynthesis of Squalene”为题发表在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上。该研究由华东理工大学特聘教授许建和领导，他主要从事生化反应工程、酶分子工程及合成生物技术研究。
▲图 | （来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）
论文指出，在解脂耶氏酵母中，DNA 双链断裂（DSBs）主要依赖非同源末端连接（NHEJ）路径，而 NHEJ 的关键组成部分是 Ku 异二聚体蛋白 Ku70 和 Ku80。这两个蛋白会结合到 DSBs 的末端，限制了同源重组（HR）的修复效率。研究人员在敲除 KU70 和 KU80 后得到了两个重组菌株 ΔKu70 和 ΔKu80。他们发现，ΔKu80 菌株的生长受到显著影响，而 ΔKu70 菌株的 HR 效率提高至 32%，且不影响其生长。因此，ΔKu70 被选作后续研究的初始菌株。
▲图 | 解脂耶氏酵母中 DNA 双链断裂（DSBs）修复途径的概述（来源：上述论文）
接着，他们在解脂耶氏酵母中过表达了与酿酒酵母中 DSBs 修复相关的基因，结果表明，过表达 RAD51、RAD52 或 RAD59 基因时，HR 效率显著增加。此外，他们还尝试将不同来源的基因组合并共过表达，以期获得更高 HR 效率的重组菌株。最后，为了优化 HR 过程，对同源臂的长度进行了调整，当同源臂长度为 1000 bp 时，取得了最佳结果，HR 效率高达 68%。
▲图 | HR 修复途径中关键基因对 HR 效率的影响（来源：上述论文）
由于 MVA 途径为生物合成各种萜类化合物提供了所需的前体——异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），研究团队以具有高 HR 效率的重组菌株 HHR 作为角鲨烯生产的底盘菌株，在此基础上，通过增加 HMG1（一个限制速率的基因）的拷贝数来提高萜类化合物的水平，并发现 tHMG1（HMG1 的截短形式）在细胞质中更稳定且提高效果相似。在上调整个 MVA 途径的过程中，通过比较不同组合基因的过表达，使角鲨烯最高产量提升到 1.34 g/L。
团队分析认为乙酰辅酶 A 和 NADPH 的高水平供应对于萜类生物合成至关重要。因此，他们首先敲除了不利基因以增加细胞质中的乙酰辅酶 A 的水平，然而角鲨烯产量增加并不显著，他们认为这可能是由于增加的乙酰辅酶 A 没有被 MVA 途径完全利用。于是，他们又引入了来自其他生物的基因来将乙酰辅酶 A 引入 MVA 途径，从而使角鲨烯的产量增加了 76%。另一方面，实验证明增加 NADPH 的供应并没有显著提高角鲨烯的产量，这意味着在当前的生物系统中，NADPH 不是角鲨烯合成的限制因素。
▲图 | 增加 MVA 途径中乙酰辅酶 A 供应的工程策略示意图（来源：上述论文）
在检测到角鲨烯产量上升的同时，他们注意到角鲨烯环氧酶（ERG1）等会催化角鲨烯向麦角固醇转化，由于该固醇对细胞生长至关重要，因此不能简单敲除相关酶基因以抑制转化，并且现有的基因抑制剂特比萘芬成本过高，不适用于工业生产。后来，他们通过结合不同强度的启动子和 ERG1 突变体，成功地将角鲨烯的产量提升到 2.4 g/L。
▲图 | 通过将三个启动子和两个突变体（ERG1F420I 和 ERG1G29S）进行排列和整合，实现它们在 ERG1 位点上的整合（来源：上述论文）
最后，在验证了目标菌株适合进行高密度发酵后，研究团队在 5 L 发酵罐中对目标菌株 SQ8 进行了进料批式培养，并关注了葡萄糖浓度对发酵过程的影响。通过精确控制葡萄糖的补充速率，最终在 144 h 的发酵结束后，角鲨烯产量高达 35 g/L，比摇瓶培养提高了 14 倍。这一产量在所有使用葡萄糖作为唯一碳源且不添加任何抑制剂的微生物中，是角鲨烯从头生物合成的最高滴定量。
▲图 | 角鲨烯在 5 L 罐式发酵器中生产，所展示的数据重复了三次。（来源：上述论文）
综上所述，这项工作设计并开发了一种改进的同源重组策略，通过增强 MVA 途径中的关键限制步骤、增加乙酰辅酶 A 的供应以及削弱固醇生物合成途径等方式，维持了细胞生长平衡，有效提高了菌株基因组整合效率，从而成功实现了高水平的角鲨烯生产。这种高水平的角鲨烯生产不仅具有重要的实际应用价值，还为在解脂耶氏酵母中生物生产其他角鲨烯衍生物提供了坚实的研究基础。
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