目前，用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae发酵生产酒精仍然是最经济的方法。因为发酵液中的高酒精浓度可以显著降低精馏操作能耗，并减少废糟液总量，进而降低废糟液处理能耗，超高密度酒精发酵技术(very high gravity，VHG)——即采用含糖质量分数高于25％的培养基_1]，使发酵终点酒精体积浓度达15％以上，正在引起人们的关注 。细胞生长和产物生成动力学是工艺过程优化和放大设计的理论依据。对酒精发酵而言，长期以来的动力学研究工作多针对批式培养和发酵系统l5。]。低浓度培养基条件下，酵母连续发酵生成酒精的稳态动力学模型也有一些报道_8 。近年来，不仅酒精连续发酵生产技术已普遍应用于工业生产中，同时VHG技术也在不断发展，但相应的动力学研究工作尚未见报道。酒精是酵母细胞的强毒性代谢物，因其抑制酵母细胞的生长，进而抑制酒精的生成。对于VHG技术来说，底物抑制也出现在多级串联系统中的前几级反应器中。另外，不同于低培养基密度条件下的稳态或拟稳态过程，在VHG条件下，我们观察到：发酵液中残糖浓度、酒精浓度以及菌体生物量不仅呈小幅度波动的拟稳态行为，而且还表现出周期性的大幅度振荡。本文对这一过程的动力学行为，包括酵母细胞生长和产物酒精生成，进行了研究。
1 材料和方法
1．1 菌种
菌种，Saccharomyces cerevisiae，加拿大滑铁卢大学化工系Murray Moo．Young教授课题组提供。
1．2 培养基
摇瓶种子培养基(g／L)：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨3。发酵罐连续培养培养基(g／L)：葡萄糖120，酵母粉5，蛋白胨3。发酵罐连续发酵培养基(g／L)：葡萄糖分别为120、200和280，酵母粉5，蛋白胨3。以上培养基在121 oC下灭菌10 min后，置于自来水槽中迅速冷却至室温，以避免抑制物的形成。
1．3 培养方法
摇瓶培养：将菌种接人装有100 mL培养基的250 mL锥形瓶中，在30℃、转数150 dmin条件下培养24 h。
发酵罐接种及培养：将摇瓶培养的种子约200mL，接人装有生长培养基的1．5 L Bioflo搅拌式发酵罐中，搅拌转数控制在300 drain，保证发酵罐达到理想全混流状态。培养与发酵的温度均控制在30℃，pH值为4．5，通气量为0．05 vvin。当发酵罐中残糖质量分数达到1 g／L左右时，开始流加培养基连续培养，控制培养基流加的稀释速率使流出发酵液的残糖水平保持在1—2 g／L。当发酵罐中菌体密度达到5 6 g／L时，培养阶段结束，切换为发酵用培养基。改变培养基流加的稀释速率，当系统达到平衡时，分析残糖浓度、酒精浓度和菌体生物量。稳态条件下，至少运行3 d；在准稳态和振荡现象出现时，系统的保持时间取决于培养基浓度和稀释率。
1．4 分析方法
酒精：由HP 5890气相色谱仪测定，70~C恒温毛细管柱，固定相为Crossbond Phenylmethyl Polysilox．ane，载气为氦气，进样温度为150~C，氢焰检测器，检测温度为250oC，Peaksnnple Data Handling System数据处理软件。残糖：采用试剂盒(Sigma Glucose Diagnostic Kit，Catalog No．115．A)进行测定。菌体生物量：由干重法测定。将lmL培养液离心、蒸馏水洗涤3次，然后置于85℃烘箱中烘至恒重，称量干菌体。酵母细胞活性：采用次甲基蓝染色法定性评价。
2 结果与讨论
2．1 稳态、准稳态和振荡采用葡萄糖质量浓度分别为120、200、280 g／L的培养基，在稀释率为0．027 h。条件下进行连续发酵实验。切换不同浓度培养基后，系统经历足够长时间，使发酵液中的酒精浓度、残糖浓度和菌体生物量与培养基中糖的消耗量相对应，然后开始间隔4 h取样，检测残糖、酒精浓度和菌体生物量，实验结果如图1 3所示。向发酵罐加料的葡萄糖浓度为120 g／L的低浓度培养基(图1)时，发酵液中残糖浓度为零，酒精浓度平均值为58．2 g／L，酵母浓度平均值为6．3 g／L。在此条件下，完全没有底物抑制，酒精抑制也较小。酒精浓度和酵母菌体生物量基本上处于稳态，波动幅度分别为各自平均值的-I-3％和-I-8％，属正常分析误差范围。当培养基中葡萄糖浓度增加到200 g／L时，发酵液中残糖浓度仍然保持在较低的水平，但出现波动现象(图2)：残糖浓度最小值、最大值和平均值分别为24．3 L、55．0 g／L和36．5 g／L，波动幅度在．33．4％与+55．0％之间，在此残糖浓度范围内，底物抑制作用仍不明显。酒精浓度平均值增加到8O．5 g／L，对酵母细胞生长有明显抑制。仔细观察实验数据可以发现，残糖浓度、酒精浓度和菌体生物量的波动状况相似，从其趋势上看，可将波动分为两种类型。其一，波动幅度相对较小、保持时间长，即准稳态过程；其二，波动幅度大、持续时间短，各发酵参数的最大值和最小值均在该阶段中出现。继续增加培养基中葡萄糖浓度至280 g／L，发酵液中酒精浓度略有降低，其平均值为74．3 g／L，残糖浓度平均值增至117．2 g／L；上述的波动现象仍然出现(图3)。为了考察大幅度波动是否是稳定的实验现象，以葡萄糖浓度为280 g／L的培养基，连续运行两个月，取样频率为每天1次。在系统运行期间，严格控制温度、pH值、稀释率、培养基组分等操作参数，结果如图4所示。结果表明：波动持续地、周期性地出现，且以发酵参数平均值为轴线呈对称分布，呈振荡特征，引发这种振荡的机理有待于进一步深入研究。
2．2 动力学模型的建立及动力学特性参数的推导
2．2．1 动力学模型的建立
酵母细胞的强毒性代谢物酒精生成后，特别是在VHG技术条件下，发酵液中酒精的累积对酵母细胞的生长有强抑制作用。以前的诸多研究_l 中已经表明，酒精对酵母细胞生长的抑制与非竞争性产物抑制的酶催化反应相似，即产物酒精只影响细胞最大比生长速率Umax=f(P)两者间关系可由广义非线性方程表示_l引：对于有底物抑制的情况，引入底物抑制系数 ，对(1)可得到Monod方程的修正n ，表达式：合并(1)，(2)，(3)，得到兼有产物抑制和底物抑制的动力学模型方程如下：在连续培养过程中，当稀释率非常低且为低浓度培养基时，系统中限制性底物通常是检测不出来的，然而在此条件下，酵母细胞的生长和酒精的生成确有发生，令此条件下的细胞比生长速率为 ，细胞实验比生长速率应为：酒精是酵母细胞的初级代谢产物，其生成与酵母细胞生长密切偶联，因此酒精的比生成速率v可用与酵母细胞生长相似的动力学模型表示：(5)式中的v 为以低稀释率流加低浓度培养基条件下酒精比生成速率，其值可以由实验测定。理论上，v、v～和 、 一可以通过得率系数关联。酵母细胞生长进入稳定期，酵母菌体的净增加量为零时，但一些酵母细胞仍在出芽或增加胞内物质的储藏，还需要糖酵解提供维持能量。考虑到这种复杂的生物现象的影响，在式(5)中引入修正的Monod常数 和修正的底物抑制常数 替换(5)式中的相应常数 和 ，得到式(6)：在连续的悬浮培养系统中，对菌体生物量进行物料衡算得到：对于连续培养过程，在控制稀释率D为定值的条件下、测定酵母菌体量和酒精浓度后，便可确定酵母细胞比生长速率和酒精的比生成速率。
2．2．2 动力学模型参数的估值
准稳态和振荡发生在高浓度培养基条件下的发酵过程中，但是相对发酵全过程而言，由于振荡持续时间短、且对称地在发酵参数平均值上下波动，我们提出了伴有短期周期性振荡现象的准稳态过程，其动力学数据如表l所示。当S Ks、P P (对于细胞生长而言)及S、P P (对于酒精生成而言)时，模型参数和 分别为O．O3和O．262 ；当S、P大于上述相应参数时， 。和v。的影响可以忽略。方程(4)、(6)中的其他模型参数通过数值计算法得到，列入表2中对于酵母细胞生长以及酒精生成而言，所能耐受的最大酒精质量浓度是167．0 g／L，远高于以前文献中报道的数值_6]，但非常接近最近研究工作报道的极限值23％ (v)¨ 。在方程(4)和(6)中，引入酵母细胞的初始比生长速率和酒精的初始比生成速率，校准了低浓度培养基及低稀释率条件下酿酒酵母S．cerevisiae的动力学行为。 和 大于文献[9，11]中的数值，表明在高产物酒精浓度和高底物残糖浓度下酵母细胞对底物的亲和性降低。 和K， 与s 基本上在一个数量级上，说明当底物浓度较高时，底物抑制作用不可忽略。实验数据与模型预测值的比较见图5和图6。对于酵母细胞生长，相关系数R =0．97；对于酒精生成相关系数R =0．95。由此可见本文建立的动力学模型比较准确地反映了高浓度培养基条件下酿酒酵母S．cerevisiae发酵的动力学特征。
3 结论
以上研究表明，不同低浓度培养基条件下的稳态或拟稳态过程，在高浓度培养基条件下的酒精连续发酵过程中，残糖浓度、酒精浓度和菌体生物量处于伴有周期性振荡现象的准稳态。本文建立了酿酒酵母生长和酒精生成的这一特定准稳态动力学模型。
