由于化石能源的储量已急剧减少,能源问题已成为制约国民经济发展的瓶颈。另一方面由于化石能源的应用,导致环境问题日益突出。因此利用生物可再生原料及太阳能生产的能源,即生物能源,成为人们关注的焦点。生物能源包括生物质能、生物液体燃料及利用生物质生产的能源如燃料酒精、生物柴油、生物质气化及液化燃料,生物质氢等[1]。其中,氢能清洁可再生,燃烧只产生水和巨大能量,有可能成为21世纪重要燃料之一。由于化学方法制氢要消耗大量的矿物资源,因而利用生物技术进行氢气生产大受世人关注。
生物制氢主要采用厌氧微生物(包括活性污泥),光合细菌及藻类。藻类产氢利用太阳能和水,制氢过程不产生污染,因而具有较大发展优势。自从ＭｅｌｉｓＡ[2]在2000年采用去硫法大幅度提高莱茵衣藻的产氢能力后,人们对莱茵衣藻产氢研究给予了极大关注。对莱茵衣藻混合营养培养的大量研究结果表明,它可以利用一些有机碳源(葡萄糖、醋酸钠)和有机氮源(尿素)[3,4,5]进行混合营养培养。发酵废水中含有很多不易去除的有机氮磷物质,它们有些是莱茵衣藻生长可利用的物质,利用废水培养藻类产氢可以变废为宝,具有极大的社会和经济效益。
味精发酵废液的主要成分,例如葡萄糖,谷氨酸等[6]可对莱茵衣藻生长、产氢产生影响,本文为探索味精废水培养莱茵衣藻并且产氢,同时净化废水的可行性提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 藻种纯化培养与培养基
藻种采用野生型莱茵衣藻(Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓｒｅｉｎ ｈａｒｄｔｉｉ),培养基(1Ｌ)为:Ｔｒｉｓ:2.42ｇ,ＣａＣｌ:37ｍｇ,ＭｇＳＯ4:48.9ｍｇ,ＫＨ2ＰＯ4:75ｍｇ,Ｋ2ＨＰＯ4:175ｍｇ,冰醋酸:1.8ｍＬ,微量元素:1ｍＬ,用ＫＯＨ调ｐＨ值。微量元素(100ｍＬ):Ｎａ2.ＥＤＴＡ:5ｇ,Ｈ3ＢＯ3:1.14ｇ,ＭｎＣｌ2·4Ｈ2Ｏ:0.51ｇ,ＺｎＳＯ4·7Ｈ2Ｏ:2.2ｇ,ＦｅＳＯ4·7Ｈ2Ｏ:0.5ｇ,ＣｏＣｌ·6Ｈ2Ｏ:0.161ｇ,(ＮＨ4)6Ｍｏ7Ｏ24·4Ｈ2Ｏ:0.157ｇ。
在培养基中加入1.5%的琼脂粉,制成固体培养基平板,再将待分离纯化的藻液通过划线方法接种在平板上,置于培养箱中,29℃培养7ｄ。从平板上挑取单藻落接入250ｍＬ三角瓶中(含有100ｍＬ液体培养基),于光照培养箱中静置培养(光照强度约125μＥ (ｍ2·ｓ)ＰＡＲ)。
混合营养培养基:在上述培养基内添加0.3ｇ/Ｌ尿素。
无硫培养基:将上述培养基内硫酸盐等量变换为氯化物。
1.2 产氢培养
用青霉素小瓶(8ｍＬ)与反口塞组成配套培养瓶,灭菌后移入6.5ｍＬ菌悬液,倒置于培养箱内,首先在27℃暗条件下诱导一定时间后,再在光照培养箱内27℃光照(125μＥ (ｍ2·ｓ)ＰＡＲ)条件培养,每天定时用微量进样器抽取瓶中气体,进行氢气含量测定。培养液取出后测藻细胞密度和ｐＨ值。
1.3 分析方法
1.3.1 生物量的测定
将一定的浓度藻液按比例稀释3倍,测定其在750ｎｍ处的吸光度(721分光光度计)。依据标准曲线计算出藻细胞数。同时可在显微镜下用血球计数板测定细胞数。
1.3.2 氢气的测定
氢气采用气相色谱(东西电子ＧＣ4000Ａ,北京)测定,分子筛5Ａ,柱长2ｍ,内径3ｍｍ,以氮气作为载气。进样体积100μＬ,柱温50℃,进样温度60℃,热导检测温度110℃。用外标法计算氢气浓度和体积。
2 结果与讨论
2.1 尿素的添加对莱茵衣藻产氢的影响
不同类型的培养基对莱茵衣藻的产氢效果是不同的。实验在暗培养23ｈ,光照培养24ｈ后测定氢气含量。对于一般培养基来说,产氢量较小,只有3.41μＬ(图1)。当在培养基中去除无机硫元素后,产氢量增加了约7倍,而添加醋酸钠和尿素后,混合营养培养的产氢效果是一般培养基的约6倍,当在培养集中同时添加醋酸钠、尿素,去除无机硫元素后,产氢效果更佳,不仅高出一般培养基的约10倍,且比单独去除无机硫元素的产氢样品和添加尿素样品都高出不少。在培养基中去硫后,破坏了莱茵衣藻的光合系统II,使得光合放氧过程受阻,在消耗氧气到较低的浓度后,莱茵衣藻诱导产生氢酶,进行催化产氢作用[2]。而在不去硫条件下,由于尿素的存在提供了充足的氮源,可能使得莱茵衣藻在暗条件下进行异养营养培养,在此过程不能进行光合放氧,只能好氧生长,由于培养瓶密封良好,在消耗氧气到较低浓度后,就有可能莱茵衣藻诱导产生氢酶,可进行催化产氢作用。在同时去硫及添加醋酸钠和尿素时,同时加强了两者的作用,使得氢酶诱导时间缩短,产氢时间延长,产氢总量增加。
在此实验基础上,考察了去硫培养基中不同含量尿素对莱茵衣藻培养以及产氢的影响。本实验设计的尿素质量浓度分别为0,0.25,0.5,0.7,0.9ｇ/Ｌ,结果见图2和图3。
尿素质量浓度不同对莱茵衣藻生长曲线的影响从培养的第二天起就非常明显。0.25ｇ/Ｌ样品的生长情况始终最好,在第7天细胞密度高达每ｍＬ5.59×106ｃｅｌｌ,为空白样品细胞密度的1.21倍。其次是0.5ｇ/Ｌ的样品生长量较大,0.7ｇ/Ｌ样品与空白样生长曲线大致相同。而当尿素质量浓度达到0.9ｇ/Ｌ时,生长为基本停滞状态,不利于莱茵衣藻的生长。因此尿素的存在,在0ｇ/Ｌ到0.7ｇ/Ｌ范围内有利于莱茵衣藻的生长和分裂,此实验为进一步采用尿素为有机氮源培养莱茵衣藻产氢的可行性提供了依据。
对于尿素影响莱茵衣藻产氢的情况来看,基本与影响生长的情况相同,添加0.25ｇ/Ｌ尿素所得氢气产量最大,为34μＬ,0.5ｇ/Ｌ样品比空白样稍微有所减少,产氢量最少的为0.7ｇ/Ｌ样品,只有5.84μＬ。
2.2 谷氨酸的添加
对莱茵衣藻产氢的影响由于味精发酵废水中通常含有的Ｇｌｕ质量浓度为1.0ｇ/Ｌ,所以本实验设计的谷氨酸质量浓度梯度分别为:0、0.3、0.7、1.0、1.4ｇ/Ｌ(图4)。谷氨酸质量浓度不同对莱茵衣藻生长曲线的影响从培养的第二天起就非常明显。0.7ｇ/Ｌ样品的生长情况始终最好,在第7天细胞密度高达每ｍＬ5.52×106ｃｅｌｌ,为空白样品细胞密度的1.49倍。1.0、1.4ｇ/Ｌ样品生长曲线大致相同,最终的细胞密度分别为每ｍＬ4.78×106ｃｅｌｌ、4.6×106ｃｅｌｌ。谷氨酸的存在,在实验范围内有利于莱茵衣藻的生长和分裂,主要可能因为谷氨酸分子内含碳和氮元素,可作为碳氮源使用。此实验为采用味精发酵废水培养莱茵衣藻的可行性提供了依据。
为了考察味精发酵废液的产氢可行性,首先考察了谷氨酸对莱茵衣藻产氢影响。实验采用添加不同质量浓度谷氨酸的去硫混合营养培养基之间进行对比。谷氨酸质量浓度梯度分别为0、0.4、0.7、1、1.4ｇ/Ｌ,实验结果见图5。实验在暗培养23ｈ,光照培养24ｈ后测定氢气含量。
由图5可以看出,添加谷氨酸的样品产氢均大于空白样品,添加谷氨酸0.4、0.7ｇ/Ｌ时,产氢量明显高于其他样品,最高时分别为60、57、78.97μＬ。添加量为1、1.4ｇ/Ｌ的样品产氢量与空白样基本相同。说明添加适量的谷氨酸对产氢是有促进作用的,这可能是由于谷氨酸的存在有助于莱茵衣藻的异氧及混合营养生长消耗氧气,使得具有较好的产氢效果。在此实验中,最佳谷氨酸添加量为0.7ｇ/Ｌ。与促进生长添加的谷氨酸量相同。
2.3 葡萄糖的添加对莱茵衣藻产氢的影响
由于葡萄糖在味精发酵废水中含量较高,同时它可作为多数微生物生长的碳源,因此,本实验设计了葡萄糖对莱茵衣藻生长的影响,在一般培养基中的葡萄糖添加梯度分别为:0、0.2、0.3、0.35、0.45ｇ/Ｌ,考察了它们7ｄ的生长情况(如图6)。
由图6可以看出,葡萄糖在一定质量浓度内对莱茵衣藻的生长是有利的,但质量浓度达到0.45ｇ/Ｌ时,藻细胞浓度明显下降,葡萄糖对莱茵衣藻生长的最有利浓度为0.2ｇ/Ｌ,在第7天藻密度为每ｍＬ5.28×106ｃｅｌｌ,是空白样的1.5倍。在添加范围为0.3～0.35ｇ/Ｌ时藻细胞密度基本相同。最终藻细胞密度分别为每ｍＬ4.5、4.22×106ｃｅｌｌ。
实验又考察了葡萄糖对莱茵衣藻产氢的作用,实验采用去硫混合营养培养基,在添加的葡萄糖浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4ｇ/Ｌ之间进行对比(图7)。实验在暗培养23ｈ、光照培养24ｈ后测定氢气含量。最大产氢量出现在0.2ｇ/Ｌ葡萄糖的样品中,最大产氢量为151μＬ,其次产氢量较大的有添加0.3ｇ/Ｌ葡萄糖的样品及0.1ｇ/Ｌ。添加量较大的0.4ｇ/Ｌ葡萄糖样品产氢量略高于空白样,但基本相同,为31.2μＬ。由此可见,添加适量的葡萄糖对莱茵衣藻产氢也有促进作用,这可能是由于葡萄糖的添加相当于添加了部分碳源,有助于莱茵衣藻的异氧及混合营养生长消耗氧气,由此具有较好的产氢效果。在此实验中,最佳葡萄糖添加量为0.2ｇ/Ｌ。
3 结论
综上所述,同时去硫和混合营养培养对莱茵衣藻的产氢的促进作用最大,其中尿素的添加量以0.25ｇ/Ｌ形成的混合营养培养产氢最佳,可达到34μＬ。谷氨酸及葡萄糖的添加对其生长和产氢也有促进作用,对莱茵衣藻生长和产氢起促进作用最大的添加量分别为,谷氨酸0.7ｇ/Ｌ,培养第7天细胞密度达每ｍＬ5.52×106ｃｅｌｌ,进入产氢24ｈ后产氢量达78.91μＬ;葡萄糖0.2ｇ/Ｌ,培养第7天细胞密度达每ｍＬ5.28×106ｃｅｌｌ,进入产氢24ｈ后产氢量达151μＬ。
