1,3 丙二醇(1,3 propanediol,简称1,3 PD)是一种重要的化工原料,20世纪90年代中期,工业上成功开发出了以1,3 PD为原料的新型聚酯材料———聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT),PTT性能优良,因此研究开发低成本的1,3 PD生产技术成为关注的热点。目前1,3 PD的生产方法主要是化学合成法。但由于微生物发酵法条件温和、选择性好、利用可再生资源、环境污染小等特点而日益受到人们的重视。
微生物法生产1,3 PD主要有两大类:美国杜邦公司和Genencor国际有限公司合作研究开发了以葡萄糖为底物,用基因工程菌生产1,3 PD的技术,并且在世界范围内申请了专利,预计于2010年实现工业化生产〔4〕;我国和欧共体国家在甘油生物歧化生产1,3 PD方面的研究十分活跃。到目前为止,已发现的所有产1,3 PD的野生菌株都是以甘油为底物的细菌。多年来在甘油生物歧化过程的代谢途径、动力学特征等方面已进行了较为深入的研究,厌氧条件下甘油作为惟一碳源的最大理论物质的量转化率为72%,辅助底物(如葡萄糖)可将甘油转化率提高至100%,发酵液中1,3 PD的最终质量浓度可达65～70g/L〔5〕。甘油的厌氧代谢主要有氧化代谢和还原代谢两条途径,微生物细胞通过氧化途径获取生长所必须的物质和能量,而通过还原途径甘油被与维生素B12相关联的甘油脱水酶(GDHt)催化脱水生成3 羟基丙醛(3 HPA),再进一步由与NADH相连的1,3 PD脱氢酶(PDOR)还原为1,3 PD〔6〕。这一过程的生理意义在于维持了NADH的代谢平衡,其中能量是维持GDHt活性的关键〔7～8〕,NADH则是3 HPA还原为1,3 PD的动力。ATP、NADH及酶活变化均能引起代谢流的改变,影响1,3 PD的产率。国内目前已经完成了甘油发酵生产1,3 PD的中试研究工作,正在向工业化试验过渡,由于纯甘油价格较高,如能利用粗甘油作为原料将会有效降低成本,使微生物发酵生产1,3 PD在生产条件、成本及环境保护等方面与化学法相比具有更强的优势和市场竞争力。本文对不同的甘油原料发酵生产1,3 PD进行了比较研究,考察了不同甘油原料对克雷伯氏菌厌氧发酵生产1,3 丙二醇的影响,为降低工业化生产1,3 PD的原料成本提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验菌种
克雷伯杆菌(Klebsiellapneumoniae),来自德国菌种和细胞收集中心(DSMZ)。
1.2 原料来源
市售分析纯甘油;山西介休维群生物公司的发酵粗甘油,甘油质量分数约90%;大连油脂化学品厂未经分离处理的皂化甘油,甘油质量分数约60%。
1.3 培养基
种子培养基和发酵培养基参照文献〔9〕,pH=7 0。培养基在使用前均在121℃下灭菌20min。
1.4 培养方法
种子培养在250mL的三角瓶中进行,装液量为100mL,保鲜膜封口保持厌氧状态,摇床转速150r/min,培养温度为37℃,培养时间为12h。摇瓶发酵实验的初始甘油质量浓度为40g/L,培养时间为16h,其他条件与种子培养相同。批式流加发酵实验在7L发酵罐中进行,初始装液量为3L,接种量为10%,搅拌转速为200r/min,发酵温度为37℃,用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH=7 0,向发酵罐中通氮气维持厌氧条件。甘油初始质量浓度40g/L,待菌体生长至对数期,发酵液中甘油消耗至一定浓度时开始流加甘油,流加采用与pH调控相偶联的策略,调节补料泵的流量与加碱泵的流量相匹配,使发酵液中甘油浓度控制在一定范围内。
1.5 分析方法生物量用650nm的光密度(OD)表示,甘油用化学滴定法检测,发酵液中的1,3 PD、乙酸和乙醇用气相色谱法(岛津GC 14B)进行检测,色谱柱为毛细管柱(50m×0 25mm×0 4μm),固定相为SE 30(交联),检测器为氢火焰离子化检测器,柱温90℃,汽化室与检测器的温度均为240℃,载气为N2,流速40mL/min,进样量0 4μL,采用外标法定量。
2 结果与讨论
2.1 不同原料摇瓶发酵实验对比
首先采用纯甘油、粗发酵甘油、低纯度皂化甘油进行摇瓶发酵实验,以确定不同原料对菌体生长和产物1,3 丙二醇生成的影响程度,实验结果如图1所示。
菌体生长情况可由OD值反映,通过摇瓶发酵实验可看出,生物量由大到小依次为发酵甘油、纯甘油、皂化甘油。纯甘油和发酵甘油的1,3 丙二醇产量较高,低纯度皂化甘油作为原料时,生物量和1,3 丙二醇产量均不理想。主要是由于低纯度皂化甘油的杂质含量较高,且成分复杂,不但对菌体的还原代谢途径产生了影响,而且对菌体的生长产生了较强的抑制作用,使菌体生长缓慢,1,3 丙二醇产量低。因此,低纯度皂化甘油不适合作为发酵法生产1,3 丙二醇的原料。
2.2 纯甘油批式流加发酵实验
采用纯甘油为原料进行批式流加发酵实验,结果如图2所示。本次实验发酵时间为32h。发酵过程中OD值在23h达到最高,为9 32,发酵液中1,3 丙二醇的质量浓度最高达到72 15g/L,甘油到1,3 丙二醇的物质的量转化率达到63.32%,生产强度为2 67g/(L·h)。
从图2可以看出,发酵液中1,3 丙二醇的质量浓度与OD值的变化有很强的正相关性,表明发酵过程为生长偶联型。从副产物乙酸、乙醇、2,3 丁二醇的产生情况看,在发酵前15h,乙酸浓度迅速增加,表明氧化代谢主要走乙酸途径,对产物1,3 丙二醇的生成比较有利。随着产物的积累,乙酸途径受到抑制,为维持NADH的平衡,乙醇、2,3 丁二醇的浓度快速积累,产物1,3 丙二醇的生成速度也相应减缓。
2.3 粗发酵甘油批式流加发酵实验
以质量分数为90%的粗发酵甘油为原料进行批式流加发酵实验,结果如图3所示。本次实验发酵时间为28 7h。发酵过程中菌体的OD值在22h达到最高,为9 27,1,3 丙二醇的最高质量浓度达到56 72g/L,物质的量转化率达到53 14%,生产强度为2 36g/(L·h)。
由图3可以看出,发酵过程中菌体的生长速度比纯甘油为原料略快,这与摇瓶发酵的实验结果吻合,主要是由于粗发酵甘油中含有的少量杂质在发酵初期促进了菌体的生长。副产物的生成情况也与纯甘油为原料的发酵结果接近,但乙醇开始积累的时间提前2h,使1,3 PD的产生较早的进入减速期,这是由于在发酵过程中原料的不断补加使其中杂质浓度升高,产生抑制效果,使代谢流发生改变,最终导致1,3 PD的积累浓度和转化率的降低。
2.4 单位产品的原料成本比较
对国内发酵甘油的生产成本进行调研发现,目前纯度为90%的粗发酵甘油的生产成本为7000元/t,而提纯到99%以上成本增至11000元/t,据此对发酵生产1,3 PD的单位产品原料成本进行了分析,结果如表1。
由表1可知,虽然采用粗发酵甘油为原料转化率低,但由于节约了甘油的精制费用,使原料成本大幅降低。如能改进工艺,使其各项指标接近纯甘油,则经济效益更为可观,这方面的工作有必要进一步深入地研究。
3 结论
通过几种不同甘油原料的发酵实验结果比较可知,低纯度的皂化甘油不适于作为微生物发酵生产1,3 丙二醇的原料;以纯甘油作为发酵原时,1,3 丙二醇的产量最高;而粗发酵甘油作为原料的各项指标低于纯甘油,但从单位产品的生产成本来看则是更为廉价的原料,同时也说明由淀粉经两步发酵生产1,3 丙二醇的工艺路线是可行的。
