近年来，随着石油的不断消耗，人们正在积极寻找替代能源—燃料乙醇[1-4]。燃料乙醇作为清洁能源，在日益重视环保的今天，更加受到关注。然而，其普及的关键还是如何降低成本。利用高浓度酒精发酵技术以及开发利用优良菌种—运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)便成了热门。运动发酵单孢菌具有高产乙醇能力，能耐高渗透压和发酵速度快等优点，有可能成为取代酵母的酒精产生菌[5]。但是该菌底物范围窄，限制了应用。目前利用生物工程手段扩展了该菌的底物范围，但仅限于实验室研究，还没有应用到工业发酵生产上。
1运动发酵单孢菌的生物学特性
运动发酵单孢菌(Zymomonas mobilis)最早是Linder于1924年从龙舌兰酒中分离得到的。 Z. mobilis为革兰氏阴性、厌氧细菌，但能够耐一定的氧气[7]。是圆端肥粗的杆状细胞，周生鞭毛运动，长1.4-2.0x4.0-5.0um，通常成对，较少成短链。泛酸盐是唯一需要的生长因子。在加入泛酸盐的合成培养基内生长，但产量仅约为在酵母膏培养基中获得的一半[8].
与其他微生物相比，该菌代谢途径相对简单，没有多种可供选择的代谢途径[9]。 Z.mobilis通过ED途径专一代谢葡萄糖、果糖、蔗糖作为碳源和能源。利用葡萄糖和果糖时，能够得到近似理论产量的乙醇[7,10]。但是以蔗糖为底物时，由于副产物果聚糖和山梨醇等的形成，转化效率降低到70%[11]。该菌具有高耐糖能力(400 g/L),高耐乙醇能力(100 g/L)、低生物量和高乙醇收率以及发酵速度快等优点。
用酒精酵母发酵时，葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，而Z. mobilis酒精发酵时，磷酸化的葡萄糖经ED途径产生丙酮酸，再脱羧还原为乙醛，继而再还原形成乙醇[12]。 EMP与ED途径相比，EMP途径1M葡萄糖可生成2 M ATP，而ED途径只生成1 M ATP。因此，对应消耗葡萄糖的菌体量，Z.mobilis比酵母少，乙醇得率高。
Z. mobilis酒精发酵的缺点是碳源利用面窄，仅限于葡萄糖、果糖和蔗糖。而且代谢中副产物较多，如乳酸、乙醛、醋酸、硫化氢等问。
2运动发酵单孢菌培养条件
2.1培养基成分对酒精发酵的影响
Othumpangat S等[[13]采用表面响应方法(RSM)分析Z.mobilis酒精发酵时各个因素之间的影响。结果表明，生物量与葡萄糖浓度和酵母膏添加量有重要关系。生物量的积累需要合适的酵母膏水平，否则高浓度的碳源也不能积累所期望的生物量。当然，随着糖浓度的提高，未能利用的糖浓度也就高，这与酵母膏就没什么关系了。在较低和中等糖浓度下，酵母膏成分对糖的利用有重要影响。增加酵母膏的浓度，乙醇产量会明显的提高，但是超过最大水平时，产量就会下降。葡萄糖浓度小于5时，最适的酵母膏浓度为0.5，就可以达到最高的乙醇产量。而葡萄糖浓度为25%时，1%的酵母膏也只能达到产量的一半。因此，最适的葡萄糖和酵母膏的匹配才能得到最大的乙醇产量。
氮源、磷酸盐、硫酸钱对发酵的影响不是很大。过多的氮源会导致过多的生物量，乙醇得率下降。乙醇浓度会随着硫酸按浓度的增加而增加，但是超过合适的水平，乙醇浓度会减少。
氧化还原电位是影响微生物生长繁殖的重要环境因素。Vore报道说低浓度的半胱氨酸、抗坏血酸和硫化钠等还原剂能提高运动发酵单孢菌ATCC 10988的生长速率[14]。
另外，有报道Z. mobilis以葡萄糖为碳源，厌氧连续发酵过程中转速(300--1100 r/min)对发酵的影响。随着转速的提高，生物量和乙醇生产能力提高，但乙醇得率维持在一恒定水平。搅拌速率影响甘油、山梨醇、果糖等副产物的形成。副产物产量在700 r/min时达到最大，在更高的速率下，副产物的形成又逐渐减少。果糖合成在700 r/min时也达到最大值。该副产物的形成是通过6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖的可逆反应得到的，因此磷酸葡萄糖异构酶的活性对果糖的形成有着重要的影响。在700 r/min时，该酶的活性最高。磷酸葡萄糖异构酶在Z.mobilis的代谢过程中有着重要的影响。
2.2淀粉质原料为碳源时的乙醇发酵研究
如果Z. mobilis仅采用葡萄糖、果糖和蔗糖发酵乙醇，则生产成本高，没有工业应用价值。因此，将生物质原料预处理后用于乙醇发酵研究的情况比较广泛。
石贵阳等[16]利用玉米原料进行Z. mobilis发酵乙醇研究，按1:3.5加水，添加a一淀粉酶和糖化酶将淀粉转化成葡萄糖后，添加营养物质CAX 20 g/L,35℃下发酵40 h后，酒精度达72g/L，残糖(还原糖）4.2g/L，淀粉利用率91.5%。孟庆恒等[[17]采用工业水解淀粉用于Z. mobilis发酵，其结果与15%和20%的葡萄糖发酵结果相似。酒精最终浓度可达9%(v/v)，发酵周期为70 h。朱浩里[18]等以早釉稻糖化液直接发酵，经78 h发酵，乙醇得率为0.484g/g，最终乙醇浓度为106.9 g/L. Nellaiah等[191利用木薯淀粉的酶法水解物(糖浓度为15%)进行酒精发酵，24 h最终酒精浓度达6.6 %(v/v)。Zhisheng Yu等[20]利用纤维素的热解物用于乙醇发酵，发现Z. mob ilis对其十分敏感，发酵缓慢。另外，还有人将甜菜底物用于该菌的酒精发酵。
总之，Z. mobilis以淀粉质原料发酵乙醇均需要将其转化成该菌能够利用的3种糖类。
3固定化细胞发酵生产乙醇
3.1运动发酵单孢菌的固定化
近年来，用固定化细胞技术来生产酒精是取代传统酒精发酵的一项新技术。固定化细胞具有提高反应器细胞密度、提高生产效率、减少乙醇的反馈抑制作用等优点。运动发酵单孢菌固定化的研究也比较深人。用子Z.mobilis固定化的方法主要有吸附法和包埋法。吸附法反应条件温和，载体可反复利用，但易引起细胞损失。因此，吸附法固定化细胞还有待进一步研究。另外，也有用离子交换树脂固定Z. mobilis进行连续酒精发酵。
包埋法是Z. mobilis常用的一种固定方法，包埋介质通常为海藻酸盐和卡拉胶。但是海藻酸盐遇磷酸不稳定，固定球机械强度不高等，容易引起球的崩裂。为了解决这个问题，有人提出用戊二醛做表面处理或在发酵液中添加CaCl2。近来，许多学者认为卡拉胶比海藻酸钙好。Grotes等人也用这两种载体分别固定Z.mobilis，发现卡拉胶固定球对糖的利用比海藻酸钙好。
3.2运动发酵单孢菌的共固定化研究
Z. mobilis碳源利用面窄是限制其应用的重要原因。将Z.mobilis和其他微生物共固定化，可以解决该不足。使用B一葡萄糖苷酶和Z. mob ilis形成的共固定化系统，不仅可以把纤维二糖转化成葡萄糖，而且可用Z. mobilis同时把葡萄糖转化成酒精。1985年，日本的HideoTanake等人成功地建立了两种细胞的共固定化系统。他们把一种糖化菌泡盛曲酶(Asp.awamori)和酒精生产菌Z. mobilis共固定在海藻酸钙中，以淀粉为原料进行酒精发酵，取得了较好的效果。Asp.awamori为好气性霉菌，Z.mobilis为耐氧型厌氧菌，共固定化后，通入一定的氧气，调节pH值，Asp.awamori在球表面生长，而Z. mobilis生长在中心的厌氧区，形成“生境隔离”，淀粉经Asp.awamori转化成葡萄糖供Z. mobilis利用。由于糖化和发酵同时进行，只要调节曲霉和细菌到合适的比例，葡萄糖就不会积累，可避免淀粉水解的抑制[6]。
郑晓东[[21]等将糖化菌 Asp.nigher3.4309与Z. mobilis共固定在海藻酸钙凝胶中，以淀粉为原料进行酒精发酵，认为当pH为5.0-5.5时，温度在30-33℃时酒精得率最高，为0.39g/g。
4利用遗传学手段改造运动发酵单孢菌
纤维素、半纤维素和淀粉作为一个巨大的可再生糖类资源库，广泛存在于甜菜、蔗渣和秸杆等农副产品以及玉米、木薯和甜高粱等农产品中。而野生型Z. mobilis只能以葡萄糖、果糖和蔗糖作为生产乙醇的底物圈。Z.mobilis的遗传改造主要是将产乙醇的关键酶(丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶II)移人其他可以利用淀粉质原料的菌种中或者将其他微生物中相关的淀粉质原料水解酶基因转移到Z.mobilis中[(23,24]，从而获得乙醇产率高的Z.mobilis菌株。
大肠杆菌能利用几乎所有的戊糖和己糖，但缺乏乙醇脱氢酶，几乎没有酒精产生。陆坚等[25]通过基因工程手段成功地将Z mobilis的乙醇脱氢酶基因adhB克隆并导人大肠杆菌中表达。同时，也已成功地克隆并表达了丙酮酸脱发酶基因。
另外，由Z.mobilis中的pdc(丙酮酸脱羧酶基因)和adhB(乙醇脱氢酶11的基因)融合构建而成的pet (Production of ethanol)操纵子，转移到碳源范围较广的微生物中，顺利完成一个完整的酒精代谢途径，获得了新的能发酵木质纤维素生成燃料酒精的工程菌株。
外源基因在Z. mob lis中的克隆和表达系统正逐步完善。目前，已构建了许多载体，但是这些载体在Z. mobilis应用中通常不稳定，如何提高外源基因的表达与活性水平是构建高性能Z.mobilis工程菌的关键。而且，由于野生型Z.mobilis具有多种抗生素抗性，限制了许多以抗性基因表达作为筛选标记的宿主质粒作为载体。另一方面，基因整合系统可提高外源基因的表达，但因工程菌株的不稳定性、其强大的修复系统以及相关的基因转移方法效率低等而很难建立。
因此，遗传改造的研究还需要继续深人。例如，通过基因工程手段增加或修饰，如增强乙醇及阻遏子忍耐性，增强半纤维素、纤维素的水解，耐热性提高以及对营养需求的进一步减少，进一步改进糖的转运能力等，以获得具有乐观前景的有利于工业生产的工程菌株。
5小结
运动发酵单孢菌以及其独特的优点，在乙醇发酵中具有广阔的应用前景。但真正应用到工业生产的例子并不多。Delle等人在美国用运动发酵单胞菌进行工业化生产酒精试验，分别用6.0x10 4 m3，和5.8x10 5 m3罐的规模进行生产。葡萄糖浓度达18%时，对运动发酵单胞菌也无抑制作用。仅发酵36 h，最终酒精浓度可达10%-13 %(v/v);转化率为95%。与酵母发酵相比，具有明显的优势。但是，过窄的底物范围是限制其应用的瓶颈。同时，该菌发酵产物成分复杂，副产物较多。
目前，对Z.mobilis的研究仅限于发酵性质的研究，得到的最终酒精浓度均不高，还没有工业应用价值。因此，与其他可代谢纤维质原料的菌株混合发酵，或利用基因工程菌直接代谢纤维质原料发酵生产酒精是将来一个具有前途的研究方向。同时，优化培养条件，找出限制Z. mobilis高浓度发酵的限制因素，进行Z.mobilis高浓度酒精发酵也具有重要意义。
参考文献:
[1]马文超，石贵阳，章克昌.玉米原料无蒸煮发酵酒精工艺的研究[J].酿酒科技，2005,(2):50-53.
[2]赵华，赵树欣，向才东，等.玉米酒精浓醒发酵技术的研究[J]酿酒科技，1998,(5):30-40.
[3]章克昌.发酵燃料酒精的建议[Jl.中国工程科学，2002,2(6): 89-93...
