(大连理工大学环境与生命学院，辽宁大连116024)
摘 要：介绍国内外关于生物转化法生产2，3－丁二醇的研究情况，其中包括转化过程中菌种的选择及其改造、发酵底物的选择、发酵条件及产量、产物的分离提纯方法等。并对该生物转化过程提出一些新的改进方法，以期降低生产成本，解决日益严重的能源危机和环境污染等问题。
关键词：2，3－丁二醇；1，3－丁二烯；葡萄糖；生物转化
2，3-丁二醇是一种极具价值的液体燃料，其燃烧值为27198J/g，可与甲醇(22081J/g)、乙醇(29005J/g)相媲美。2，3-丁二醇可以用来制备重要的工业有机溶剂甲乙酮；还可以用来生产2-丁烯和1，3－丁二烯等橡胶单体；酯化形式的2，3-丁二醇是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆晶、洗液等；通过催化脱氢得到的二乙酰化形式的2，3－丁二醇可以用做具有高价值香料的食品添加剂。
2，3-丁二醇自身可以作为单体用来合成高分子化合物；左旋形式的2，3-丁二醇由于其较低的凝周点可用做抗冻剂；此外，2，3－丁二醇还在染料、炸药、香水、药物载体等领域显示出潜在的应用价值。
从最初Harden和WalPole研究生物转化法生产2，3-丁二醇至今已有近百年的历史。二战期间，为了弥补1，3-丁二醇的稀缺，2，3-丁二醇的生产倍受关注。近年来，随着工业生产的蓬勃发展，2，3-丁二醇的需求量逐年增加。目前，2，3-丁二醇的工业生产主要是生物转化法。
有关该生产工艺的研究，国外进行的较早，取得的成绩也较显著，而国内还尚属初级阶段。以木质纤维素的水解液为原料，通过细菌将碳水化合物转化为2，3-丁二醇有望进一步降低生产成本。本文通过介绍目前有关生物转化法生产2，3-丁二醇的研究情况，并提出一些新的研究想法，旨在推动国内在该领域研究的进步。
1 菌种及其改造
目前，用来发酵生产2，3-丁二醇的微生物主要是细菌类，包括Klebsiella pneumoniae、Klebsiellaoxytoca、Bacillus poJymyxa、Aeromonas Aydrophilia、Paenibacillus poymyxa等。这些细菌在发酵生成目标产物2，3-丁二醇的同时还会产生乙偶姻、乙醇、乙酸、乳酸等副产物。其中乙偶姻是2，3-丁二醇的前体化合物，在乙偶姻还原酶的作用下转化为2，3-丁二醇。
不同菌种发酵产生2，3-丁二醇的光学纯度亦有所不同。例如：Bacillus polymyxa主要生成D-(-)－2，3-丁二醇；B.subtilish和AeromonasHydrophila可生成D－(-)-2，3-丁二醇和Dleso-2，3－丁二醇；Serra tiamarcescens可生成L-(+)－2，3-丁二醇和meso-2，3－丁二醇，但以后者为主。在这些菌种当中，以Klebsiella pneumoniae研究的最多，因为其底物范围很宽，可以同时以葡萄糖和木糖为底物，而且它的适应环境能力较强。
利用基因工程技术改造菌种以提高目标产物的表达同样在生物转化法生产2，3－丁二醇工艺上受到了重视。Kristina BIomqvist等发现表达2，3-丁二醇途径关键酶α-乙酰乳酸、α-脱羧酶、乙酰乳酸合成酶和乙偶姻还原酶位于Klebsiellaterr由ella的同一个操纵子上，且该操纵子在Enterobacter aerogenes中也被发现。Peng Wei-ling等将包含Klebsiellapneumoniae acoABCD操纵子的基因导入Escherichiacoli发现其上游基因序列对2，3－丁二醇相关酶基因的表达起重要作用。
当用tac作为启动子时，导人Escherichia coli的L-BDH基因得到了高强度的表达，但所表达的L-BDH的立体特异性有所降低。Ui等将Klebsiella pneumoniae IAMl063中2，3-丁二醇代谢途径的相关酶基因导人Escherichia coliJM109，并用葡萄糖做底物，获得了光学纯度较高的目标产物。
2 底物的选择
生物转化法生产2，3－丁二醇可选用的底物种类很多，其中最常用的底物是葡萄糖和D－木糖、L木糖、D-核糖、D-阿拉伯糖等多种五碳糖。Mas等分别用葡萄糖、木糖、乳糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖等做底物，利用B.polymyxa ATCC 842和ATCC 12321发酵，
比较了2，3－丁二醇的产率情况。Lee和Maddox曾用乳糖做底物生产2，3-丁二醇，Perego等采用淀粉水解液做底物，研究了温度、接种体积以及底物浓度对目标产物的影响情况。
Berbert-Molina等采用糖果罐头残汁做碳源，并用磷酸氢二胺做惟一氮源进行发酵生产2，3－丁二醇。在对Klebsiella pneumoniae发酵研究中发现，当以甘油为底物时，产物有2，3－丁二醇和1，3-丙二醇两种，并且这两种产物的比例随发酵条件如pH、通氧量的改变而改变。
对于各种发酵工艺来说，最为理想的底物是木质纤维素降解物。木质纤维素是生物圈中含量最为丰富的有机物质，其化学组成主要包括纤维素、半纤维素和木质素，此外还包括少量的果胶和腊等。三种主要组成物质在木质纤维素中所占的比例随着植物种类的不同而表现出明显的差异。一般说来，纤维素占木材干重的45％，半纤维素约占木材干重的25％～30％，木质素约占25％～30％。
但木质纤维素的降解存在着一系列的难点，木质纤维素作为植物细胞壁的主要组成成分，经过亿万年的进化使其具有很强的自我保护功能，它通过3种主要组分之间的多种相互作用，形成复杂的空间结构，具有很强的抗酸、抗碱、抗酶解的能力。因此，一般的物理、化学和微生物作用，其降解效果都不是很好。
Yu等用纤维素和半纤维素做底物，在连续发酵过程中共同培养Trichoderma harzianum E58和Klebsiella pneu－moniae，首先利用Trichoderma harzianum E58的降解能力获得葡萄糖和木糖，再利用KlebsieUa pneumonioe进行转化生产2，3-丁二醇。能够利用木质纤维素降解产物进行生物转化的菌种要具备一些重要性质，如较宽的底物利用范围，较高的产率，较少的副产物，较强的抗抑制性等。
3 发酵条件及产量
发酵时，pH值、温度、通氧量等是3个非常重要的选择条件，它们共同影响着菌体的生长情况、代谢途径及目标产物的光学纯度。由于生物转化过程实质上就是菌体内的一系列酶促反应过程，酶的活性自然在很大程度上影响发酵效果。
而酶的活性又是受控于pH值、温度等因素。另外，在菌体内通常存在不止一种代谢途径，多种代谢途径的存在使菌体能更好地适应外界条件的变化，以达到最佳能量利用效率。与此同时，培养基组成、底物浓度、接种体积等也是发酵的重要影响因素。
据Yu等报道，在pH值为6.5，温度为30℃且通少量氧气的条件下，Klebsiella pneumoniae可转化50g/L的D－葡萄糖和D-木糖，分别产生25g/L和27g/L的2，3-丁二醇，但是转化效率随着底物浓度的增加而降低，而且在低底物浓度的条件下，有氧比微氧时发酵效率要.低。Nakashimada等报道在用Paenibacillus poly-myxa进行流加发酵时，生成2，3－丁二醇的最佳稀释率为0.2h-1。其光学纯度在各种稀释率时均高于98％。
随着pH值的提高，2，3-丁二醇和乙醇的产量增加，但2，3－丁二醇光学纯度降低，当pH值为5.7时，光学纯度降为94％。在另一篇报道中，时批式发酵Paenibacillus polymyxa 24h后，100mM木糖获得39mM 2，3－丁二醇、65mM乙醇和47mM乙酸。
Zeng等利用呼吸商定量研究通氧量对菌体发酵的影响。发现在连续发酵过程中，当呼吸商在4.0～4.5之间时，2，3-丁二醇和乙偶姻的总量达到最大。在批式发酵过程中，控制最佳呼吸商，可获得产物浓度高达102.9g/L(96.0g/L 2，3-丁二醇+6.9g/L乙偶姻)。
4 产物的提纯
产物2，3-丁二醇的有效提纯一直是阻碍其大规模工业生产的一个重要原因。由于2，3-丁二醇本身的一些性质，
如高沸点、高亲水性以及发酵液中溶解的其他杂质使得该提纯过程非常困难。目前研究较多的提纯方法有：过蒸发、膜蒸馏、真空膜蒸馏和有机溶剂萃取。过蒸发即利用浓度梯度，通过非多孔膜进行组分的选择扩散。膜蒸馏即通过多孔疏水膜进行的蒸发过程。
而真空膜蒸馏即为二者的结合。有机萃取中使用的萃取剂有正丁烷、二乙基乙醚等。该方法已在实验室规模取得一定成绩。Tsao发现使用二乙基乙醚可回收发酵液中75％的2，3－丁二醇。Ghosh等采用双水相法进行发酵，试图提高发酵液中目标产物的浓度，同时也为后续的分离工作带来方便。不过，更加有效的提纯方法仍需继续探索。
5 展望
自然界中可用来发酵生产2，3-丁二醇的菌种较多，这为菌种的选择提供了较大的余地，但由于2，3－丁二醇属于菌体代谢的次级产物，其产量受到了一定的限制。通过基因工程技术将相关基因导人E.coli.来表达大量目标产物是目前和今后研究的一个重点方向。同时可以考虑直接将其导入原菌种进行表达，以减少菌种对异种基因的排斥作用。
而通过对菌体乙醇、乙酸代谢途径的关键酶进行抑制，提高通过目标产物的通量。当目标产物在菌体中大量积存时，必然会抑制菌体的正常代谢，通过增加细胞膜的通透性，并及时将目标产物从发酵液中提取出来，可避免其对菌体代谢的负面影响。而且，2，3-丁二醇存在3种立体异构体，其对应的代谢酶也有着高度的立体专一性。阐明该催化过程的立体特异机制，提高目标产物的光学活性纯度同样会是今后的一个研究重点。
在利用木质纤维素降解产物作为发酵底物方面，目前亟待解决的问题有：①木质纤维素复杂空间结构的探索；②有关降解酶降解作用机理揭示；③高效、稳定、特殊的降解酶的筛选及其基因克隆；④降解微生物及酶的生物学改造。
在发酵工艺上，应进一步考虑菌体在整个发酵过程中所处的不同生长时期的代谢特点。当菌体处于不同的生长时期时，其对碳源、氮源以及能量的利用上必然有所不同，而这些不同又必然导致代谢途径中各个支路通量的不同，以至影响目标产物的产量。因此，可以考虑在发酵初期适当提高呼吸商，加快菌体生长，而后将呼吸商恒定为生产目标产物产量的最适值。随着发酵工艺各个环节的逐渐成熟，相信2，3-丁二醇的大规模生物转化法生产将指日可待。
